Farklı kan seyreltme yöntemlerinin test edilmesindeki yardımları için Dr. Daniel Haisenleder'e teşekkür ederiz. Serum hormon tahlilleri, Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061 tarafından desteklenen Virginia Üniversitesi Üreme Ligand Testi ve Analiz Çekirdeği Araştırma Merkezi'nde gerçekleştirildi. Michigan Fare Metabolik Fenotipleme Merkezi-Live, NIH Center Grant U2C DK135066 tarafından desteklenmektedir. JF ve NQ, DK020572 (MDRC) ve DK089503 (MNORC) hibeleri tarafından desteklenmektedir. CFE ve CSM, NICHD hibe R21 HD109485 ve R01 HD096324 tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu18'in yanı sıra federal, eyalet ve yerel yasalara uygun olarak gerçekleştirilir. Bu protokol gösterimi için dört C57BL / 6J dişi ve dört Kiss1-Cre dahil olmak üzere yetişkin dişi fareler (3-6 aylık) kullanıldı; ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) dişiler. Fareler, 22 ° C'de sıcaklık kontrollü 12: 12 ışık: karanlık döngüsü altında tutuldu ve düşük fitoöstrojenli bir diyetle ad libitum ile beslendi. Prosedürler ve protokoller Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC, Hayvan Protokolleri: PRO00010420 ve PRO00010138) tarafından onaylandı.
1. AAV'lerin belirli bir hücre popülasyonuna stereotaksik olarak verilmesi
<ol><li>Ameliyat için hazırlık<ol><li>Tüm aletleri sterilize edin. Her paketin en fazla beş hayvanda kullanılmasını sağlamak için birden fazla cerrahi alet paketi hazırlayın. Her hayvan için en az bir çift olmak üzere steril eldivenler hazırlayın.</li>
		<li>Yavaş ve istikrarlı bir şekilde enjekte edilen ve kolayca tıkanmayan uzun ince mikropipetler için aşağıdaki ayarları ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak enjeksiyonlar için cam mikropipetleri çekin: Isı 1: 915, Isı 2: 630, Çekme: 630. Her çektirme için bu ayarları optimize edin.</li>
		<li>Ameliyatları belirlenmiş bir cerrahi alanda gerçekleştirin. Cerrahi yüzeyleri% 70 etanol ile dezenfekte edin.</li>
		<li>Cerrahi alanın sterilliğini korumak için steril örtüler kullanın. Temiz bir laboratuvar önlüğü veya tek kullanımlık önlük ve maske giyin.</li>
		<li>İnhalasyon anestezi sistemini hazırlayın. Oksijen kaynağını açın ve akış hızını 0,8 L/dk'ya ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ameliyat<ol><li>Fareyi bir anestezi kutusuna yerleştirin ve izofluranı% 2.5'e kadar açın. İlk indüksiyondan sonra izofluran akışını% 2'ye düşürün; Prosedür boyunca akışı koruyun. Alternatif anestezi yöntemleri için hayvan protokolüne ve yerel etik kurul kılavuzlarına bakın.</li>
		<li>Hayvan kullanım komitesi tavsiyesine ve yerel yönetmeliklere uygun olarak önleyici analjezik (carprofen 5 mg / kg sc) enjekte edin.</li>
		<li>Saç kesme makinesi kullanarak fare kafasını tıraş edin.</li>
		<li>Hayvanı stereotaksik bir masaya yerleştirin, kulak çubuklarını yerleştirin ve başın doğru şekilde sabitlendiğinden ve sabit olduğundan emin olun. Farenin ağzını ağızlığa sabitleyin, boğulmayı önlemek için dili ağzın dışına yerleştirdiğinizden emin olun.</li>
		<li>Ameliyata başlamadan önce hayvanın bir ayak parmağı kıstırmasıyla derin bir şekilde uyuşturulduğunu doğrulayın ve işlem boyunca farenin nefesini ve rengini izleyin.</li>
		<li>Gövdeyi ve kafayı yatay konumda düz tutmak için farenin altına yükseklik desteği yerleştirin. Hayvanı kağıtla kaplı ılık bir bezle sıcak tutun. Kurumasını önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün.</li>
		<li>Ameliyat bölgesini mümkün olduğunca temiz tutun. Steril eldiven giyin. Cildi açmadan önce farenin kafasını iyot ve alkolle dezenfekte edin. Bir neşter ile, kafadaki cildi orta hat boyunca, yaklaşık olarak gözlerin arkasından lambda sütürünün arkasına kadar kesin. Kafatasını açıkta tutun ve steril% 0.9 NaCl içine gömülü bir pamuklu çubukla temizleyin.</li>
		<li>Rostral rinal veni (RRV) bulun ve steril bir kalemle işaretleyin. İşlemin geri kalanı için stereoskopu kullanın. NOT: RRV'yi ön-arka referans olarak kullanarak daha iyi sonuçlar elde ederiz, ancak bregma'yı referans olarak kullanmak standarttır.</li>
		<li>Referans olarak steril bir iğne kullanarak, stereotaksik ölçümlere geçmeden önce beyin oryantasyonunun doğru olduğundan emin olun. Ayrıca RRV ve lambda'daki kafatası yüzeyinin yüksekliklerinin yanı sıra yanal eğimin de aynı olduğundan emin olun (± 0,02 mm). NOT: Yanal eğim, daha yanal beyin yapılarına enjeksiyon için daha uygun hale gelir.</li>
		<li>Enjekte edilecek viral çözelti ile steril bir cam pipet yükleyin. Referans 0 anteroposterior (AP) için RRV referansına getirin. Sagital sütür boyunca tercih edilen AP koordinatına ilerleyin. Bu pozisyonu steril bir kalemle işaretleyin, iğneyi kaldırın ve kraniotomiye geçin.</li>
		<li>Superior sagital sinüsün kırılmasını önlemek için işaretli pozisyonun etrafında küçük bir daire çizin. Delme sırasında basıncı azaltmak için matkabı dik yerine eğimli bir konuma yerleştirin. Kafatasının parçasını küçük forseps ile çıkarın.</li>
		<li>Damar sistemi açığa çıktığında, mediolateral (ML) referans olarak kullanmak için superior sagital sinüsün ortasını kullanın (nokta 0); Bu, sagital sütür kullanmaktan daha hassastır. Tercih ettiğiniz ML konumuna geçin. Dorsoventral (DV) referansı olarak dura-mater'e dokunmak için pipeti indirin (nokta 0). Dura-mater'ı hafifçe kırın ve pipeti tercih edilen DV konumuna indirin.</li>
		<li>İstenilen miktarda AAV (50-200 nL) enjekte edin ve yeterli sıvı dağılımına izin vermek için kanülü 3 dakika yerinde bırakın. Pipeti dikkatlice beyinden çıkarın.</li>
		<li>Fareyi kulak çubuklarından ayırın. Cerrahi klipsler veya tercih edilen herhangi bir yöntemi kullanarak cildi kapatın. Hayvanı iyileşmesi için ayrı bir ısıtılmış kafese koyun. Fare uyandıktan sonra toparlanmayı, reaktiviteyi ve aktiviteyi izleyin. Tamamen iyileştiğinde, fareyi orijinal kafesine geri götürün.</li>
	</ol></li>
	<li>İşlemin ikinci kısmına geçmeden önce viral ekspresyon için en az 3-4 hafta bekleyin.</li>
</ol>2. Juguler ven ve karotis arter kanülasyonu
<ol><li>Ameliyat için hazırlık<ol><li>Ameliyatları belirlenmiş bir cerrahi alanda gerçekleştirin. Prosedürlere başlamadan önce cerrahi yüzeyleri %70 etanol ile dezenfekte edin. Her paketin en fazla beş hayvanda kullanılmasını sağlamak için birden fazla cerrahi alet paketi hazırlayın.</li>
		<li>Tüm cerrahi aletleri otoklavlayın. Ardından, steril su veya tuzlu su ile temizleyin ve ameliyatlar arasında aletleri en az 15 saniye (üreticinin talimatlarına göre) sıcak boncuk sterilizatörü ile dezenfekte edin.</li>
		<li>Cerrahi alanın sterilliğini korumak için steril örtüler kullanın. Temiz bir laboratuvar önlüğü veya tek kullanımlık önlük ve maske giyin.</li>
		<li>Karotis arter ve juguler vendeki kanülasyonlar için mikro kateterler hazırlayın. Silastik boru (0.025 inç OD x 0.012 inç ID) ile küçük bir mikrorenatan tüp segmentini (0.025 inç dış çap [OD] x 0.012 inç iç çap [ID] arasında gerilmiş) birleştirerek arter kateterini oluşturun. Venöz kateteri sadece silastik boru (0.025 inç OD x 0.012 inç ID) kullanarak oluşturun. Ameliyattan önce tüm kateterleri gece boyunca %70 etanole batırın.</li>
		<li>Her iki kateterin kesik uçlarını, hayvanın vücut ağırlığına ve uzunluğuna bağlı olarak önceden tahmin edilen uzunluklara 45° eğim verin.</li>
	</ol></li>
	<li>Cerrahi prosedürler<ol><li>Ameliyat sırasında anestezi aşamasını ve düzlemi hassas bir şekilde kontrol etmek için masa üstü düşük akışlı izofluran sistemi ile %2 izofluran altındaki hayvanları uyuşturun.</li>
		<li>Önleyici analjezik dozunu (carprofen 5 mg / kg sc) enjekte edin ve kuruma ve kornea yaralanmalarını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>Boynun ventral ve sırt bölgelerini tıraş edin ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak üç iyot peelingi ile cildi temizleyin. Kürek kemikleri arasında dikey bir cilt kesisi (12 mm) kesin ve daha sonra kullanmak üzere cerrahi gazlı bezle örtün. Hayvanı, başı cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
		<li>Aşağıda açıklanan prosedürlerin çoğu bölümü için bir stereo diseksiyon kapsamı kullanın.</li>
		<li>Sağ karotis arteri ve juguler veni ortaya çıkarmak için boynun sağ tarafında, klavikula üstünde, küçük bir dikey kesi (~ 10 mm) yapın. Cildi makasla kesin ve sağ dış juguler veni ve sağ ortak karotid arteri ortaya çıkaran, ince uçlu dişli olmayan mikro forseps kullanarak deri altı dokuları ayırmak için künt bir diseksiyon yapın.</li>
		<li>Kan akışını durdurmak için juguler venin distal ucunu bağlayın ve mikro forseps ve makas kullanarak çökmüş damarda küçük bir delik açın. Sağ atriyum seviyesine ulaşmak için üst vena kava boyunca ilerletmek için bir çift mikro forseps kullanarak venöz kateter eğimini aşağı ve proksimal olarak yerleştirin. Takılan uzunluk, 30 g yağsız bir fare için ~ 10-12 mm'dir. 7-0 ipek dikişler kullanarak damara sabitlemek için kateteri bağlayın. NOT: Kateter doğru yerde olduğunda, kan kolayca çekilebilir; Aksi takdirde, kateter lateral torasik ven içine yanlış yerleştirilebilir ve yeniden yerleştirilmesi gerekebilir.</li>
		<li>Sternohyoid kas, sternomastoid kas ve digastrik kas ile çevrili üçgen bir alanda bulunan sağ ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için bağ dokularını dikkatlice inceleyin. Gerekirse bu kasları ayırmak için bir tel toplayıcı kullanın. Arteri, 7-0 ipek sütürler kullanarak iç ve dış karotis arterlerin çatallanması seviyesinde bağlayın. Bağlanmamış iki dikiş halkasını proksimal olarak yerleştirin.</li>
		<li>Önceden yerleştirilmiş bir dikiş halkasını çekerek kan akışını geçici olarak durdurun ve mikro makas veya 27 G'lik bir iğne kullanarak damar duvarında küçük bir delik açın veya delin. Arteriyel kateter eğimini aşağı ve proksimal olarak aort kemerine ulaşan, ancak aort kapağına dokunmadan önceden tahmin edilen bir uzunluğa yerleştirin. Takılan uzunluk, 30 g yağsız bir fare için ~9-10 mm'dir. Önceden yerleştirilmiş iki sütür kullanarak damarla sabitlemek için kateteri bağlayın.</li>
		<li>Tüm kateterleri deri altından tünelleyin ve önceden kesilmiş kesi yoluyla boynun arkasında dışa doğru hizalayın ve bunları 25 G iğneli borudan yapılmış silikon kaplı bir boru konektörünün venöz veya arteriyel portlarına birleştirin: iki adet 25 G iğne borusu ve iki adet 4.0 cm PE-20 boru kullanılarak modifiye edilmiş MASA19 , küçük bir metal telden yapılmış halka ile tutturulmuş 2.0 cm 0.062 inç ID silastik boru ile kılıflı. Konektör dahil her kateterin toplam lümen hacmi 6-8 μL'dir (Şekil 1A).</li>
		<li>Ventral insizyonu kapatın ve konektörü arka cildin dikişlerle kapatılması üzerine deri altından sabitleyin. Her iki kateteri de heparinize salin (200 U/mL) ile doldurun ve sonunda paslanmaz çelik cerrahi tellerle sıkıca kapatın.</li>
		<li>Fareler birkaç dakika içinde izofluran anestezisinden kurtulur ve 5 gün içinde ameliyattan tamamen iyileşir. Hayvanları ameliyattan 24 saat sonra otomatik kan alma muhafaza odasına yerleştirin ve sistemin bağlantı kancasını boynun arkasına implante edilen boru konektörüne bağlı metal halkaya bağlayarak sisteme bağlayın. Arteriyel ve venöz kateterleri, örnekleme başlamadan 24 saat önce sırasıyla enjeksiyon ve örnekleme hatlarına bağlayın (Şekil 1B). Örnekleme hattının toplam uzunluğu 55 cm uzunluğunda veya lümen hacminde 40 μL'dir. NOT: Enjeksiyon ve numune alma hatlarının kurulumları, toplama yönteminin programlanması ve otomatik kan numune alma sisteminin kafes denge mekanizmaları ayrıntılı olarak açıklanmıştır20,21. Sistem, her 20 dakikada bir otomatik olarak 10 μL heparinize salin vererek kateteri açık tutar.</li>
		<li>Enjeksiyon öncesi örnekleme, enjeksiyon ve enjeksiyon sonrası örnekleme süresini ve sıklığını sistemin bilgisayar programı aracılığıyla ayarlayın. Geçerli ayarlar için aşağıdaki adım 3.1'e bakın.</li>
		<li>Sistem, muhafaza odasını fare hareketine zıt yönde döndürürken fare hareketini algılayarak hayvanın örnekleme ve/veya infüzyon hatlarını dolaştırmadan serbestçe hareket etmesini sağlar21 (Şekil 1).</li>
		<li>İnfüzyon veya enjeksiyon hattını bileşikle tekrar doldurun ve infüzyon veya enjeksiyon başlamadan en az 2 saat önce venöz katetere yeniden bağlayın. NOT: Ameliyat komplikasyonları meydana gelebilir ve hayvanların iyileşme için ve ameliyatı takip eden günlerde yakından izlenmesi gerekir. Doğru izleme, sonlandırma gereksinimleri ve prosedürleri için hayvan protokolüne bakın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Otomatik kan alma ve intravenöz enjeksiyon
<ol><li>Otomatik kan alma<ol><li>Bu protokolü takip etmek için, 20.0 μL'lik bir örnekleme hacmi kullanın ve örnek başına her 7.0 dakikada bir örnekleme frekansına sahip olmak için her örnekleme arasında bir aralık (yani 10.0 dakika) ayarlayın. Maksimum hız, 3.0 dakika / numunede sürekli örnekleme yapmaktır; mümkün olan minimum örnekleme hacmi 5.0 μL'dir. Örneklenen kanın yerini almak ve vücut sıvı dengesini korumak için sistem tarafından eşit miktarda salin otomatik olarak geri verilir.</li>
		<li>Toplam örnekleme süresini intravenöz CNO enjeksiyonundan önce 30 (t = -30 - 0) dakika ve 30 (t = 0 - 30) dakika sonra ayarlayın (0.5 mg / kg, Şekil 2).</li>
		<li>Toplanan her kan örneği (20.0 μL) otomatik olarak 50 μL salin (10 U/mL'de heparin içerir) içinde seyreltilir ve sistem tarafından soğutulmuş bir numune karuselinde tutulan bir mikrotüp içinde ayrı ayrı saklanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Otomatik intravenöz enjeksiyon<ol><li>Kan örneklemesi başlamadan en az 2 saat önce CNO'yu (0.5 mg / kg'da ~ 50-60 μL hacimce ayrı ayrı hesaplanan doz) yeniden doldurmak için venöz hattı venöz kateterden ayırın.</li>
		<li>Çözeltiyi (hesaplanan hacimden biraz daha fazla) enjeksiyon şırıngası ile geriye dönük olarak hattan manuel olarak çekin ve çözelti ile hattaki mevcut salin arasında küçük bir hava kabarcığı bırakın.</li>
		<li>Enjeksiyon hattını venöz katetere yeniden bağlayın ve enjeksiyon hızını 500 μL/dk'ya ve t = 0 örnekleme bittikten sonra enjeksiyonun başlama süresini 2 dakikaya ayarlayın. Her hayvan için toplam enjeksiyon süresi 5-6 saniyedir. NOT: Gerekirse, bileşik manuel bir intraperitoneal enjeksiyon (IP) ile de verilebilir, ancak bu, kan alma protokolü sırasında veya öncesinde hayvanın rahatsız edilmesini gerektirecektir. Bu alternatifi sonuçlarda da gösteriyoruz.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hayvan perfüzyonu ve beyin toplama (İSTEĞE BAĞLI)
NOT: Bu prosedür yalnızca beynin nöronal aktivasyon veya aşağı akış tepkilerinin beyin bölgesini analiz etmesi gerekiyorsa izlenmelidir.
<ol><li>Toplama protokolünün sonunda fareyi kan alma sisteminden ayırın. İntravenöz enjeksiyondan iki saat sonra, tercih edilen yöntemi kullanarak veya başka bir yerde tarif edildiği gibi% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ile hayvanı perfüze etmeye devam edin22.</li>
	<li>Beyni diseke edin ve fiksasyona devam etmek için 3 saat boyunca% 10-NBF'de% 20 sükrozda koruyun.</li>
	<li>3 saat sonra, sabit beyni PBS'de% 20 sükroza aktarın ve kesit almaya hazır olana kadar 4 ° C'de muhafaza edin. NOT: cFOS antijenlerini maskeleyeceği için aşırı fiksasyondan kaçının. % 20 sükroz çözeltisinde, beyin kabın dibine batmalıdır.</li>
	<li>Dondurucu bir mikrotom veya kriyostat kullanarak kesitler yapın ve nöronal aktivasyona bakmak için tercih edilen yöntemi kullanın (örneğin, cFOS immünohistokimyası gösterilmiştir). NOT: Mevcut sonuçlar için kullanılan antikorlar Malzeme Tablosunda açıklanmıştır.</li>
</ol>5. Numune işleme ve analiz
<ol><li>Deneyin bitiminden hemen sonra kan örneklerini otomatik örnekleyiciden çıkarın ve buza koyun.</li>
	<li>Numuneleri 30 saniye boyunca 14.000 × g'da döndürün.</li>
	<li>Plazmayı toplayın. Analize kadar -80 °C'de saklayınız.</li>
	<li>Kan örneklerini daha önce tarif edildiği gibi LH ELISA ile testedin 10,23.</li>
</ol>

DREADDs Teknolojisi ve Otomatik Kan Örneklemesi

<ol>
	<li>Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+promote+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+congenitally+hypogonadal+(hpg)+male+mice.">Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice.</a> Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).</li><li>Coquelin, A., Desjardins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone+and+testosterone+in+young+and+old+male+mice.">Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).</li><li>Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stalk+portal+blood+collection+in+rhesus+monkeys:+Evidence+for+pulsatile+release+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH).">Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH).</a> Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).</li><li>Schuiling, G., Gnodde, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+origin+of+the+pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone+in+long-term+ovariectomized+rats.">Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats.</a> Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).</li><li>Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+lactation-induced+infertility+in+female+mice.">Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice.</a> Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).</li><li>Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+circadian+disruption+on+female+mice+reproductive+function.">Impact of circadian disruption on female mice reproductive function.</a> Endocrinology. 161 (4), (2020).</li><li>Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+Enables+Chronic+Corticosterone+to+Inhibit+Pulsatile+Luteinizing+Hormone+Secretion+and+Suppress+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).</li><li>Moenter, S. M., Evans, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+GnRH+measurements+in+pituitary+portal+blood.">Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood.</a> Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).</li><li>Maeda, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LHRH+pulse+generator:+A+mediobasal+hypothalamic+location.">The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li><li>Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pulsatile+and+surge-like+luteinizing+hormone+secretion+with+frequent+blood+sampling+in+female+mice.">Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).</li><li>Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., P&#233;vet, P., Buijs, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+clock+output+stimulates+melatonin+synthesis+at+night.">Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).</li><li>Herwig, A., P&#233;vet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-pineal+microdialysis+in+the+Djungarian+hamster+(Phodopus+sungorus):+A+tool+to+study+seasonal+changes+of+circadian+clock+activities.">Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities.</a> Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).</li><li>Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+is+essential+for+the+sexual+dimorphism+of+GH+secretion,+corticosteroid-binding+globulin+production,+and+corticosterone+levels+in+mice.">Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice.</a> Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).</li><li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors.">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Eighth+edition.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition.</a> National Research Council. , (2011).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).</li><li>Peters, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+ABS+Part+I:+Introduction+to+automated+blood+sampling.">Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling.</a> Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).</li><li>Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+Automated+blood+sampler+part+II+Managing+freely-moving+animals+and+monitoring+their+activity.">Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity.</a> Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+ultra-sensitive+ELISA+for+measurement+of+LH+in+mice.">A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice.</a> Endocrinology. 163 (9), (2022).</li><li>Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+acts+directly+and+indirectly+to+increase+gonadotropin-releasing+hormone+neuron+activity+and+its+effects+are+modulated+by+estradiol.">Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol.</a> Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+subpopulations+of+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+female+mice.">Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice.</a> Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 1-8 (2009).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+surge+profiles+of+luteinizing+hormone+secretion+in+the+mouse.">Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+different+roles+of+hypothalamic+kisspeptin+neurons+in+regulating+female+reproduction.">Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction.</a> eLife. 8, 43999 (2019).</li><li>McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+tail-tip+blood+sampling+in+mice+for+the+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).</li><li>Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glial+fibrillary+acidic+protein+(Gfap)-expressing+cells+in+the+regulation+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH)+but+not+arcuate+kisspeptin+neuron+output+in+male+mice.">A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice.</a> eLife. 10, e68205 (2021).</li><li>Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+suppression+of+GnRH+neurons+during+pubertal+development+can+alter+adult+GnRH+neuron+firing+rate+and+reproductive+parameters+in+female+mice.">Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice.</a> eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).</li><li>Talbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Action+of+Tachykinin+Signaling+on+Pulsatile+LH+Secretion+in+Male+Mice.">Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice.</a> Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).</li><li>Tuli, J., Smith, J., Morton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+puberty.">Sleep and puberty.</a> Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 17, 1-7 (2021).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokolü kullanarak, bir nöronal popülasyonun uyarılmasından sonra bazal LH pulsatilitesini ve LH sekresyonunu gösterebildik. Sistemin en büyük avantajları, kan örneklemesi sırasında insan varlığı veya elleçleme olmaksızın örneklemenin gerçekleştiği stressiz ortamdır. Ek olarak, deney sırasında önceden zahmetli bir hayvan eğitimi ve insan varlığına veya kullanımına adaptasyon gerekli değildi. Manuel kan örneklemesi kullanan önceki deneyler, stres faktörlerini en aza indirmek için büyük miktarda zaman ve çaba gerektiriyordu 7,31,32. Bununla birlikte, kuyruğu tek başına kesmek bir stres kaynağıdır33. Kesintilerin öngörülemez olduğu ortak hayvan tesislerinde stressiz bir ortam ve eğitim paradigması uygulamak da bir kısıtlama olabilir. Bazı laboratuvarlarda, hayvanların genellikle kan örneklemesi için alternatif prosedür odalarına taşınması gerekir. Bu sınırlamalar, LH seviyelerindeki ince değişikliklerin tespiti için manuel yöntemi uygunsuz hale getirebilir ve bu nedenle, bu durumlarda uygulamalı bir yaklaşım yardımcı olabilir. Otomatik örnekleme, farelerin yeni ortama alışmaları için birkaç gün önceden yerleştirildiği sessiz bir odaya yerleştirilir. Bu protokolle ilgili önceki deneyimimiz, farelerde kortikosteron ve pulsatil büyüme hormonu sekresyon paternlerinin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladı ve otomatik örnekleme sırasında yüksek kortikosteron seviyeleri göstermedi15. Mevcut deneylerde, tüm hayvanlar, ~ 24 saat sonra örnekleme odasında yuva kurmayı ve parlak saç rengini gösteren örnekleme sistemine iyi adapte olmuşlardır, bu da stres eksikliğini ve genel sağlık durumunu gösterir (Şekil 1).
Olumsuz sonuçlara yol açan ana zorluk, muhtemelen AAV'nin gerekli nöronal popülasyona uygun olmayan şekilde hedeflenmesidir. Stereotaksik enjeksiyonlarda hassasiyet esastır ve koordinatları ve enjeksiyon hacimlerini doğrulamak için önceden eğitim yapılmalıdır. Eğitim, iyileşmeyen cerrahide istenen yere az miktarda %0.5-1 Evans Blue enjekte edilerek ve daha sonra bir fare beyin matrisi (örneğin, Ted Pella) kullanılarak yeni disseke edilmiş beynin bir dilimini alarak enjeksiyonun yerini ve boyutunu kontrol ederek bir stereoskop kullanarak yapılabilir.
Otomatik kan örnekleme sisteminden toplanan kan ve plazmanın heparinize salin içinde seyreltileceğini de hesaba katmak önemlidir (örneğin, sonuçlarımızda 50 μL salin içinde 20 μL kan)20 ve seyreltme oranının seçilen analitik yöntemin duyarlılığına göre ayarlanması gerekebilir. BSA-PBS (Ultra Hassas LH ELISA için önerildiği gibi)10 veya salin ile seyreltilmiş tam kandaki LH seviyelerini test ettik ve LH değerlerinde hiçbir fark bulamadık. Ara, seyrelticide kullanılamaz, çünkü bu, numune sıvılarını20 değiştirerek numuneleri çıkarmak için kan sistemine dolaşacaktır. Deneyimlerimize göre, 1:10'dan daha düşük dilüsyonlar iyi LH sonuçları verdi, ancak LH seviyelerini 1:3.5'e kıyasla biraz hafife aldı. Bu, gerekirse toplanan kan miktarını azaltmak için seyreltmenin daha da ayarlanabileceğini gösterir.
Otomatik bileşik dağıtımına bir alternatif, venöz kateter yoluyla manuel enjeksiyonlar yapmaktır. Bu durumda, araştırmacı enjeksiyonu yapmak için odada kısa bir süre bulunur. Bununla birlikte, hayvanlarla veya barınaklarıyla ve çevreleriyle doğrudan temas yoktur ve intraperitoneal veya subkutan enjeksiyonların aksine, tüm prosedür genellikle hayvan tarafından fark edilmez. Manuel enjeksiyonun avantajları, bileşik seyreltmenin önceden ayarlanmasının gerekmemesidir, bu da daha büyük hacimlerde kullanılamayacak kadar pahalı olan veya zamanla bozulmaya duyarlı bileşikler için kritik olabilir; Çalışma hacmi, infüzyon hattının ve kateterin daha fazla bileşik çözelti ile önceden doldurulması gereken otomatik dağıtımdan daha küçük olduğundan.
Otomatik kan örneklemesi, örneğin uyku sırasında LH varyasyonlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Örnekleme sırasında yuvalarında uyuyan hayvanları düzenli olarak gözlemledik. Nöral aktivite ve LH paterni34 arasındaki ilişkinin daha ayrıntılı bir analizini oluşturmak için bu örneklemeyi EEG kayıtlarıyla ilişkilendirmek mümkündür. Burada gösterildiği gibi, otomatik kan örneklemesini kullanma olasılıkları çoktur: bazal LH örneklemesinden LH yanıtının endojen veya eksojen bileşiklere test edilmesine veya nöronal popülasyonların aktivasyonuna veya baskılanmasına kadar. Nöronal manipülasyonlar, kemogenetik veya optogenetik ile akut olarak veya transgenik fare modelleri ve apoptotik veya nöronal susturma araçları kullanılarak kalıcı olarak uygulanabilir. Otomatik kan örneklemesi ayrıca yüksek pulsatil salgı modellerine sahip diğer hormonların ölçülmesine de izin verir (örneğin, büyüme hormonu15). Dişi farelerde, östrus döngüsünün belirli bir aşaması gerekiyorsa, vajinal yaymalar, infüzyon ve örnekleme hatlarını bozmadanprotokol 26'ya başlamadan saatler önce dikkatlice toplanabilir. Hayvanlar örnekleme sistemine 7-10 gün boyunca bağlanabilir ve zamanla artan atardamar hattının pıhtılaşma riski vardır.
Bununla birlikte, bu teknik, tek barınaklı hayvanlarda kullanımla sınırlıdır ve bu nedenle sosyal etkileşimleri incelemek için uygun olmayabilir. Aynı zamanda invazivdir ve teknik olarak zorlu cerrahi gerektirir, bu nedenle yavru hayvanlarla veya belirli hastalık modelleriyle uygulanması mümkün olmayabilir. Son olarak, sistemi satın alma maliyeti tek bir araştırma laboratuvarı için çok yüksek olabileceğinden, söz konusu deney protokolünü hizmet olarak sağlayan bir çekirdek laboratuvarda kurulması tavsiye edilir.
Sonuç olarak, bu protokol, otomatik kan örneklemesi ile birlikte AAV'nin stereotaksik uygulamasının nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Bu teknikle elde edilen hassas uzamsal ve zamansal kontrol, farklı modellere, ölçüm protokollerine ve hormonlara uygulama esnekliği ile birlikte, onu kemirgenlerde hormonal regülasyonun incelenmesi için güçlü bir yöntem haline getirir. En önemlisi, yöntem, enjeksiyon ve/veya numune alma sırasında insan varlığını ve elleçlemeyi ve önceki hayvan eğitimini ortadan kaldırarak stressiz bir ortam sağlar. Bu avantajlar, çoğullama olasılığı ile birlikte, bu yöntemi bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde hormonal değişikliklerin sinirsel kontrolünü incelemek için benzersiz bir araç haline getirir.

Hipotalamo-hipofiz-gonadal (HPG) ekseni, gonadotropin salgılatıcı hormonun (GnRH) hipofiz portal sistemine pulsatil salınımı ile merkezi olarak düzenlenir. Hipofiz bezinde GnRH, gonadotropinlerin, luteinize edici hormonun (LH) ve folikül uyarıcı hormonun (FSH) dolaşım sistemine pulsatil salınımını kontrol eder. LH pulsatil salınımı, 1,2,3,4 işleyen merkezi HPG ekseni için bir ayırt edici özellik görevi görür. Örneğin, genetik değişikliklerin veya hormonal veya çevresel faktörlerdeki değişikliklerineksen 5,6,7'nin nöral kısmı üzerindeki etkilerini gösterir. Yakın zamana kadar, LH pulsatil paterninin ölçülmesi, yüksek örnekleme sıklığı ve nabızları tanımlamak için gerekli olan büyük kan hacimleri göz önüne alındığında, büyük memeliler8 ve sıçanlar9 ile sınırlıydı.
Farelerde LH darbelerinin tespit edilmesi arzu edilir, çünkü bu tür geniş genetik modellere sahiptir ve spesifik genleri ve hücre popülasyonlarını daha fazla incelemek için genomik mühendislik teknolojileri kullanılarak kolayca manipüle edilebilir. Son on yılda, bir sandviç LH enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanılarak farelerde LH konsantrasyonlarının analizinde büyük bir ilerleme, LH'nin bir dakika kanda tespit edilmesine izin vermiştir10. Sık kuyruk ucu kan örnekleme tekniğinin geliştirilmesi, farelerde LH darbelerinin frekansını ve genliğini tespit etmek için gerekli sık örneklemeyi mümkün kılmıştır10,11. Bununla birlikte, kuyruk ucu kan örneklemesi, bilinçli uyanık hayvanlarda kullanımı ile sınırlıdır; Farelerin işleme uyum sağlaması ve örnekleme sırasında belirlenmiş bir araştırmacının varlığına uyum sağlaması için uzun bir eğitim süresi gerektirir. Başarısı çevresel stres faktörlerine karşı oldukça hassastır ve yüksek düzeyde kaygı gösteren fare suşlarında kullanım için uygun olmayabilir. İntra-atriyal kanülasyon, serbestçe hareket eden bilinçli farelerde sık kan örneklemesi için de kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu kurulum hala tekrarlanan manuel kan örneklemesi gerektirir ve hayvanların hareket alanını kısıtlarken, atriyal kanülasyon kalp fonksiyonunda dinamik değişikliklere yol açabilir. Bu nedenle, bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde stressiz koşullar altında, önceden eğitime veya insan kullanımına veya varlığına ihtiyaç duymadan kan toplama için bir yöntem oluşturulması arzu edilir.
Otomatik kan veya diyalizat örneklemesi, dizginlenmemiş kemirgenlerde farklı hormon seviyelerini (örneğin, melatonin13,14) ve bunların pulsatil sekresyonunu (örneğin, büyüme hormonu)15 ölçmek için daha önce kullanılmıştır. Burada, bilinçli ve kontrolsüz hayvanlarda otomatik uzun süreli sık kan örneklemesi için bir protokol sunuyoruz ve kemogenetik teknolojileri kullanarak belirli nöronal popülasyonların zamanında uzaktan aktivasyonu ile birleşiyor: tasarımcı ilaçlar (DREADD'ler) tarafından özel olarak aktive edilen tasarımcı reseptörler. Adeno-ilişkili bir virüs (AAV) vektörünün stereotaksik iletimini ve otomatik intravenöz (IV) klozapin-N-oksit (CNO) iletimi ile uzaktan aktivasyonu açıklayacağız16,17. Bu protokol, aynı anda birden fazla hayvanda bazal seviyelerin ve LH pulsatilitesinde indüklenen değişikliklerin sıralı olarak saptanmasına izin verir. Bileşiğin hem kan örneklemesi hem de IV uygulaması, araştırmacının fiziksel varlığını veya önceden fare eğitimi gereksinimini ortadan kaldıran bir bilgisayar programı aracılığıyla zaman kontrollü bir şekilde gerçekleştirilir. Bu yöntem, manuel kan örneklemesinin ana sınırlamalarının üstesinden gelir. Stressiz bir durumda kan örneklemesine ve uzaktan nöronal aktivite kontrolü ile birlikte eşzamanlı IV bileşik dağıtımına izin verir. Otomatik kan örneklemesinin tek başına veya uzaktan nöronal aktivasyon ile birlikte kullanımının temsili sonuçlarını gösteriyoruz ve avantajlarını, sınırlamalarını ve ek kullanımlarını tartışıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>44361</td>
			<td>Not necessarily this virus but this was the one used for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction box</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction machine</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia masks for mice</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip applier 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip remover 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclips 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Culex Controller</td>
			<td>Culex</td>
			<td>SN: 2151, 2152, 2156, 2158</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Honey Comb Fraction Collector</td>
			<td>Honey Comb</td>
			<td>SN: 2105, 2106, 2107, 2108</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Ratrun Rotation Control</td>
			<td>RATURN 2</td>
			<td>SN: 5680, 5681, 5682, 5683</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td></td>
			<td>JAX # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>ENZO</td>
			<td>BLM-NS105-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULEX Automated In Vivo Sampling System</td>
			<td>BASi</td>
			<td>DS000627</td>
			<td>with CX-4000S Replacement Tubing Sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>61100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis control Module</td>
			<td>EMPIS CM</td>
			<td>SN: 174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis Programmable Infusion System</td>
			<td>EMPIS</td>
			<td>SN: 2125 , 2126, 2127, 2128</td>
			<td>With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envigo 2016 diet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>low-phytoestrogen diet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Petrolatum Ophtalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MIB100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>RS-7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine Surgical scrub</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>Fluriso</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Surgivet or Kent Scientific Corp</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Anesthesia Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice</td>
			<td></td>
			<td>&#160;JAX # 023436 and #024109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kisspeptin-10</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td>048-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-renathane tubing&#160;</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>Surgical catheterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;RS-7842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter injector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>P30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X2</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-6808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Liveo Laboratory Tubing</td>
			<td>NO.508-001</td>
			<td>0.012 in I.D x 0.025 in O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic table</td>
			<td>RWD</td>
			<td>E06208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades</td>
			<td>SKLAR</td>
			<td>06-3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>f-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>&#160; RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cFos&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABE457</td>
			<td>Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21209</td>
			<td>Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry monoclonal (16D7)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M11217</td>
			<td>Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote neuronal activation coupled with automated blood sampling to induce and measure circulating luteinizing hormone in mice

Dolaşımdaki luteinize edici hormon (LH) seviyeleri, üremenin hipotalamik-hipofiz kontrolünün işleyişinin önemli bir indeksidir. LH salınımının modülasyonunda çok sayıda girdinin ve nöronal popülasyonun rolü hala bilinmemektedir. Farelerde LH seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek, çevresel stres tarafından kolayca bozuldukları için genellikle zor bir iştir. LH salınımını ve pulsatiliteyi ölçmek için mevcut teknikler, farelerin manipülasyon stresine, belirli kısıtlamalara, araştırmacının varlığına ve bireysel hayvanlar üzerinde çalışmaya uyum sağlamaları için uzun süreli eğitim gerektirir ve bu da birçok araştırma sorusu için kullanışlılığını azaltır.
Bu makale, bilinçli, serbestçe hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde otomatik sıralı kan örneklemesi ile birlikte Tasarımcı İlaçlar Tarafından Özel Olarak Aktive Edilen Tasarımcı Reseptörü (DREADD'ler) teknolojisini kullanarak belirli nöronal popülasyonları uzaktan aktive etmek için bir teknik sunmaktadır. İlk olarak, DREADD'leri eksprese eden adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörlerini spesifik nöronal popülasyonlara iletmek için stereotaksik cerrahi protokolünü tanımladık. Daha sonra, karotis arter ve juguler ven kanülasyonu ve CULEX otomatik kan örnekleme sistemine cerrahi sonrası bağlantı için protokolü açıklıyoruz. Son olarak, uzaktan nöronal aktivasyon ve otomatik kan toplama için klozapin-N-oksit intravenöz enjeksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu teknik, belirli bir süre boyunca her 5 dakikada bir veya daha uzun sürede, istenen bir zaman noktasında veya süresinde intravenöz madde enjeksiyonu ile birlikte programlanmış otomatik örneklemeye izin verir. Genel olarak, bu tekniğin nöroendokrin kontrol üzerine araştırmalar için güçlü bir yaklaşım olduğunu gördük.

The hypothalamo-pituitary-gonadal (HPG) axis is centrally regulated by the pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) into the pituitary portal system. In the pituitary gland, GnRH controls the pulsatile release of gonadotropins, luteinizing hormone (LH), and follicle-stimulating hormone (FSH) to the circulatory system. LH pulsatile release serves as a hallmark for central HPG axis functioning1,2,3,4. For example, it displays the effects of genetic alterations or changes in hormonal or environmental factors on the neural part of the axis5,6,7. Until recently, measuring the LH pulsatile pattern was limited to large mammals8 and rats9, given the high frequency of sampling and large blood volumes necessary to identify the pulses.
Detecting LH pulses in mice is desirable since this species has broad genetic models available and can be readily manipulated using genomic engineering technologies to further study specific genes and cell populations. In the last decade, a large advance in the analysis of LH concentrations in mice using a sandwich LH enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has allowed for detecting LH in a minute amount of blood10. The development of the frequent tail-tip blood sampling technique has made possible the necessary frequent sampling for detecting the frequency and amplitude of LH pulses in mice10,11. However, tail-tip blood sampling is limited to its use in conscious awake animals; it demands a long training period for mice to adapt to the handling and the presence of a designated investigator during sampling. Its success is highly susceptible to environmental stressors and may not be suitable for use in mouse strains showing high levels of anxiety. Intra-atrial cannulation has also been used for frequent blood sampling in freely-moving conscious mice12. However, that setup still requires repeated manual blood sampling and restricts animal moving space, while atrial cannulation can lead to dynamic changes in cardiac function. It is therefore desirable to establish a method for blood collection under stress-free conditions in conscious, freely moving, and undisturbed mice without the need for prior training or human handling or presence.
Automated blood or dialysate sampling has been used before for measuring different hormone levels (e.g., melatonin13,14) and their pulsatile secretion (e.g., growth hormone)15 in unrestrained rodents. We herein present a protocol for automated long-term frequent blood sampling in conscious and unrestrained animals, coupled with a timely remote activation of specific neuronal populations using chemogenetic technologies:&#160;the designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs). We will describe the stereotaxic delivery of an adeno-associated virus (AAV) vector and the remote activation by an automated intravenous (IV) delivery of clozapine-N-oxide (CNO)16,17. This protocol allows for the sequential detection of basal levels and induced changes in LH pulsatility in multiple animals at the same time. Both the blood sampling and the IV delivery of the compound are conducted in a time-controlled manner via a computer program eliminating the physical presence of the investigator or the requirement for prior mouse training. This method overcomes the main limitations of manual blood sampling. It allows for blood sampling in a stress-free condition, and simultaneous IV compound delivery coupled with remote neuronal activity control. We show representative results of the use of automated blood sampling alone or combined with remote neuronal activation and discuss its advantages, limitations, and additional uses.

Yazar Spotlight: Bilinçli Farelerde Hassas Hormonal Analiz için Otomatik İnfüzyon ve Kan Örneklemesi

Farelerde Dolaşımdaki Luteinize Edici Hormonu İndüklemek ve Ölçmek için Otomatik Kan Örneklemesi ile Birleştirilmiş Uzaktan Nöronal Aktivasyon

Our goal is to understand the role of specific neuron populations in the regulation of the pulsatile secretion of luteinizing hormone. For this, we require precise control of neuron allocation, identity, and activity, in combination with the sequential collection of blood samples without disturbing or stressing the animals. Current method for collecting sequential blood samples in conscious mice are limited to tail cuts, require a long changing period, and are susceptible to human handling and environmental stresses.Automated infusion and blood sampling can be conducted without presence of investigators, which it limits stress and allows for the capture of hormonal changes in conscious, free-moving, and undisturbed mice. This technique is a asset to neuroscience research as it provides a robust support system. The Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center offers automated infusion and broad sampling experiments as a core service.

Hipotalamusun kavisli çekirdeğinde bulunan Kisspeptin eksprese eden nöronlar (Kiss1 geni), GnRH'nin ve dolayısıyla hipofiz bezinden LH salınımının güçlü bir uyarıcısıdır24,25. Bu protokol gösteriminde, otomatik kan örnekleme tekniğinin işleyişini göstermek için kisspeptin kaynaklı LH sekresyonunu kullandık. Şekil 2, daha önce kavisli çekirdekte tek taraflı stereotaksik AAV-hM3Dq-mCherry enjeksiyonu alan yetişkin Kiss1-eYFP dişilerinde temsili LH paternlerini göstermektedir (AP: -4.95, ML: -0.35, DV: -5.7). ChR2-eYFP, Kiss1 hücreleri için bir floresan raportör olarak kullanıldı. Stereotaksik cerrahiden bir ay sonra, farelere karotis arter ve juguler ven kanülasyonu uygulandı ve ameliyattan 4 gün sonra otomatik kan örnekleyiciye bağlandı. Bazal LH düzeylerini belirlemek için kan alımları ertesi gün 10 dakikalık örnekleme sıklığında (örnekler arasında 7 dakika aralık ve 3 dakika / örnekleme) başlatıldı, ardından otomatik bir IV CNO enjeksiyonu yapıldı ve 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir kan örneklemesine devam edildi. Diestrous LH seviyeleri genellikle düşüktür (Şekil 2A), ancak pulsatil salınımı nedeniyle genellikle varyasyonlar gözlenir (Şekil 2B). CNO enjeksiyonunu (ve kisspeptin nöronlarının aktivasyonunu) takiben, LH'deki artış keskindi (10 dakika içinde). Artış seviyesi ve zirvenin süresi, enjeksiyon bölgesi, aktive edilen nöron sayısı veya hedeflenen popülasyon dahil olmak üzere çok sayıda faktöre bağlıdır.
Şekil 3 , Şekil 2A'da temsil edilen dişi farenin kavisli çekirdeğindeki enjeksiyon beyin bölgesini göstermektedir. Kiss1-eYFP nöronları yeşil renkle etiketlenirken, mCherry immünoreaktivitesi AAV enjeksiyonunun ve CNO'yu takiben aktivasyonun yerini gösterir. Aktive nöronlar, DAB ile etiketlenmiş cFOS immünoreaktivitesi kullanılarak tespit edildi. Çoğu mCherry nöronu Kiss1-eYFP ile kolokalize edildi ve birçoğu cFOS immünoreaktivitesi gösterdi, bu da viral ve nöronal aktivasyonun hedeflenen popülasyona özgü olduğunu gösterdi.
Diestrous wildtype (C57BL / 6J) farelerde temsili bir LH pulsatil salınım paterni ve ardından bir IP kisspeptin-10 enjeksiyonuna yanıt Şekil 4'te gösterilmektedir. Fareye karotis arter kanülasyonu uygulandı ve ameliyattan 4 gün sonra otomatik kan örnekleme sistemine bağlandı. Ertesi sabah östrus döngüleri kontrol edildi ve26. günde kan alma ve kisspeptin-10 enjeksiyonu yapıldı. Başlangıç seviyelerini ve LH pulsatilitesini belirlemek için 2 saat boyunca her 7 dakikada bir (4 dakika aralıkla artı enjeksiyondan önce 120 dakika boyunca 3 dakika / örnekleme) kan örnekleri toplandı, ardından IP kisspeptin-10 enjeksiyonu (65 μg / kg) ve her 7 dakikada bir 30 dakika daha kan alımına devam edildi. Düşük bazal LH seviyeleri, ~2 atım / saat nabız frekansı ve ~ 1 ng / mL27 nabız genliği gösteren, diestrous'ta bir kadın için tipik olan net LH darbeleri gözlendi. Kisspeptin uygulamasına yanıt olarak LH'de ani ve güçlü bir artış tespit edildi28. LH sekresyon paternleri ve stimülasyondan sonraki değişiklikler, manuel kan alma 10,27,29,30 kullanan diğer çalışmalarla uyumludur. Bu sonuçlar, otomatik kan örnekleme yönteminin stressiz bir koşul altında tipik ve uyarılmış LH sekresyonunu yakaladığını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig01.jpg"> Şekil 1: İnfüzyon ve örnekleme sistemi tüpüne konektör sistemi ve fare bağlantılarının ayrıntıları. (A) İki adet 25G iğneli boru ve iki adet PE-20 boru kullanılarak yapılmış, küçük bir metal halka ile tutturulmuş silastik bir boru içine yerleştirilmiş silikon kaplı bir boru konektörü (MASA). (B) Numune alma kafesindeki infüzyon ve numune alma tüpüne bağlı, kan numunesi alma sırasında yuvasında dinlenen bir fare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig02.jpg"> Şekil 2: Kavisli çekirdeğe AAV-hM3Dq enjekte edilen ve CNO ile uzaktan aktive edilen Kiss1-Cre dişi farelerde LH darbeleri için temsili sonuçlar. Bazal LH düzeyleri yarım saat boyunca her 10 dakikada bir ölçüldü. Kan alımını takiben 0. zamanda, kadına intravenöz bir klozapin-N-oksit (0.5 mg / kg) enjeksiyonu yapıldı ve yarım saat daha her 10 dakikada bir karotis arterden kan toplanmaya devam etti. (A) Düşük bazal LH seviyelerine sahip bir dişi gösterir. (B) LH nabız preenjeksiyonu gösteren bir dişi gösterir. Kısaltmalar: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno ilişkili virüs; CNO = klozapin-N-oksit; LH = luteinize edici hormon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig03v2.jpg"> Şekil 3: Kiss1-Cre'nin kavisli çekirdeğindeki beyin aktivasyonu; Şekil 2A'da temsil edilen Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) dişi. ChR2-eYFP sadece kiss1 nöronlarını etiketlemek için bir muhabir gen olarak kullanıldı. (A) Kavisli çekirdekteki AAV enjeksiyonunun yerini gösteren düşük büyütmeli floresan görüntüsü. Yeşil: eYFP immünoreaktivitesi, Macenta: mCherry immünoreaktivitesi. (B) Şekil 3A'ya karşılık gelen alanın, Arcuate çekirdeğindeki AAV enjeksiyonu bölgesinde cFOS immünoreaktivitesini (siyah) gösteren düşük büyütmeli parlak alan görüntüsü. (C) Şekil 3A,B'deki nöronların daha yakından bakışını gösteren yüksek büyütmeli floresan ve parlak alan görüntüsü birleştirildi. Aktive edilmiş AAV-mCherry'yi birlikte eksprese eden Kiss1-eYFP nöronları, beyaz sitoplazma ve siyah çekirdeğe (oklar) sahip olanlardır. Ölçek çubukları = 50 μm (A,B), 20 μm (C). Kısaltmalar: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno ilişkili virüs; eYFP = geliştirilmiş sarı floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig04.jpg"> Şekil 4: Diestrous vahşi tip bir dişide bazal LH pulsatilitesi 2 saat boyunca her 7 dakikada bir ölçülmüştür. Dişi daha sonra 0 zamanında intraperitoneal kisspeptin-10 (65 μg / kg) enjeksiyonu aldı ve kan örnekleri yarım saat boyunca her 7 dakikada bir sürekli olarak toplandı. Kısaltma: LH = luteinize edici hormon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice at JoVE.com

Luteinize edici hormon (LH) pulsatilitesi, üreme fonksiyonunun ayırt edici özelliğidir. Seri otomatik kan alımına bağlı belirli nöronal popülasyonların uzaktan aktivasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Bu teknik, bilinçli serbest hareket eden ve rahatsız edilmemiş hayvanlarda zamanlanmış hormonal modülasyona, çoğullamaya ve LH seviyeleri üzerindeki manipülasyon etkilerini en aza indirmeye izin verir.

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Amacımız, luteinize edici hormonun pulsatil sekresyonunun düzenlenmesinde spesifik nöron popülasyonlarının rolünü anlamaktır. Bunun için, hayvanları rahatsız etmeden veya strese sokmadan kan örneklerinin sıralı toplanmasıyla birlikte nöron tahsisi, kimliği ve aktivitesinin hassas kontrolüne ihtiyacımız var. Bilinçli farelerde sıralı kan örnekleri toplamak için mevcut yöntem, kuyruk kesikleri ile sınırlıdır, uzun bir değişim periyodu gerektirir ve insan kullanımı ve çevresel streslere karşı hassastır.Otomatik infüzyon ve kan örneklemesi, stresi sınırlayan ve bilinçli, serbest hareket eden ve rahatsız edilmemiş farelerde hormonal değişikliklerin yakalanmasına izin veren araştırmacıların varlığı olmadan gerçekleştirilebilir. Bu teknik, sağlam bir destek sistemi sağladığı için sinirbilim araştırmaları için bir varlıktır. Michigan Fare Metabolik Fenotipleme Merkezi, temel bir hizmet olarak otomatik infüzyon ve geniş örnekleme deneyleri sunar.

remote-neuronal-activation-coupled-with-automated-blood-sampling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

818 Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Amacımız, luteinize edici hormonun pulsatil sekresyonunun düzenlenmesinde spesifik nöron popülasyonlarının rolünü anlamaktır. Bunun için, hayvanları rahatsız etmeden veya strese sokmadan kan örneklerinin sıralı toplanmasıyla birlikte nöron tahsisi, kimliği ve aktivitesinin hassas kontrolüne ihtiyacımız var. Bilinçli farelerde sıralı kan örnekleri toplamak için mevcut yöntem, kuyruk kesikleri ile sınırlıdır, uzun bir değişim periyodu gerektirir ve insan kullan...

Video: Yazar Spotlight: Bilinçli Farelerde Hassas Hormonal Analiz için Otomatik İnfüzyon ve Kan Örneklemesi

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Nörobilim

Stereotaxic Delivery of Adeno-Associated Viruses to a Specific Cell Population Linked to Serial Automated Blood Collection

To begin, inject a preemptive analgesic into an anesthetized mouse. Using clippers, shave the head of the mouse. Install the animal on a stereotaxic table and correctly position ear bars.Attach the mouse's mouth to the mouse piece and carefully position the tongue outside to prevent suffocation. After checking the depth of anesthesia, position elevation support beneath the animal to ensure the body and head remain leveled horizontally. And use a warm pad with paper to maintain the animal's temperature.Apply ointment to both eyes to prevent dryness. Then, using iodine and alcohol, disinfect the mouse's head. Use a scalpel to make an incision along the head's midline with the cut stretching from behind the eyes to post the lambda suture.Expose the skull and swab it with a sterile cotton tip saturated in 0.9 sodium chloride solution. Under a stereo microscope, identify the rostral rhinal vein or RRV and use a sterile pencil to mark it. Using a sterile needle as a reference, confirm the orientation of the brain.Ensure no change in the DV and ML coordinates. Next, position a sterile glass pipette containing the virus solution to the RRV reference for zero anteroposterior reference. Advance the pipette along the sagittal suture until reaching the chosen anteroposterior coordinate.Mark this spot with a sterile pencil and lift the needle. Carefully drill a small circle around the marked position to avoid breaking the superior sagittal sinus, and remove the piece of the skull with small forceps. Then, using the superior sagittal sinus median as the mediolateral reference, move the pipette to the position and lower it until it touches the dura mater as the dorsoventral reference.Create a slight break in the dura mater and lower the pipette to the preferred dorsoventral position. Inject the specified quantity of adeno-associated virus or AAV vectors into the brain and remove the pipette. Free the mouse from the ear bars, then close the skin using surgical clips.transition the animal into a separate warmed cage to recover. Keep an eye on the mouse's recovery. Once it regains consciousness, return it to its original enclosure when fully recovered.

Adeno ile İlişkili Virüslerin Seri Otomatik Kan Alımına Bağlı Belirli Bir Hücre Popülasyonuna Stereotaksik Verilmesi

Jugular Vein and Carotid Artery Canulation for Automated Blood Sampling in Mice

To begin, inject the mouse with AAV-associated vectors into the mouse brain. After three to four weeks of virus injection, shave the ventral and back areas of the neck of an anesthetized mouse. Clean the shaved areas using three iodine scrubs in rotation with 70%ethanol solution.Make a ventral incision in the skin between the shoulder blades. Afterward, place surgical gauze over the incision and position the animal in a supine state, with its head facing toward the surgeon. Then make a small vertical incision on the right side of the neck, above the clavicle, to expose the right carotid artery and jugular vein.After separating the subcutaneous tissue, expose the right external jugular vein and place the suture under the vein. Tie off the distal end of the jugular vein to halt the blood flow. Using micro forceps and scissors, make a small incision in the collapsed vein.Now, insert the venous catheter with the bevel facing downward, and move it proximally towards the superior vena cava until it reaches the right atrium. Using a 7-0 silk suture, secure the catheter to the vessel. Dissect the connective tissues to expose the right common carotid artery.Proximally, pre-place two 7-0 silk sutures'suture loops that remain unfastened at the level where the internal and external carotid arteries divide. To stop the blood flow temporarily, pull a pre-placed suture loop. Then, using micro scissors or a 27-gauge needle, create a small opening on the vessel wall.Insert the arterial catheter proximally while releasing the suture loop, and advance the catheter to reach the aorta arch, without touching the aortic valve. Use the two pre-placed sutures to fasten the catheter to the vessel. Tunnel all catheters subcutaneously, exteriorize them at the back of the neck via the pre-cut incision, and close the ventral incision.Join the catheters to the venous or arterial ports of the silicone-coated tubing connector made from 25-gauge needle tubing. After closing the ventral incision, secure the connector subcutaneously when the back skin is sealed with sutures. Using stainless steel surgical wires, fill the catheters with heparinized saline and tightly plug the ends of the catheters.To attach the animal on an automated blood collection system 24 hours postsurgery, connect the tether hook to the metal ring on the back of the neck and connect the arterial line. Once the arterial catheter is connected to the injection line, attach the venous catheters to the sampling lines. Set the injection time and dose at 0.5 milligrams per kilogram at 500 microliters per minute.Set the blood sampling time and frequency, including the sample dilution with saline. The system will automatically replenish an equal amount of saline to replace the sampled blood. Perform automated pre-injection.Next, perform an automated intravenous injection of the drug clozapine N-oxide at an injection rate of 500 microliters per minute. Then perform post-injection blood sampling. Luteinizing hormone patterns in adult Kiss1-EYFP females that received a unilateral stereotaxic injection of AAV-hM3Dq-mCherry in the arcuate nucleus are presented.Diestrus luteinizing hormone levels are generally low, but variations are usually observed because of its pulsatile release. A sharp rise in luteinizing hormone levels occurs in response to clozapine N-oxide injection. Most mCherry neurons co-localized with Kiss1-EYFP demonstrated that the viral and neuronal activation is specific to the targeted population.A luteinizing hormone pulsatile pattern of release in diestrus wild-type mice, followed by the response to an IP injection of Kisspeptin-10, is shown. Clear luteinizing hormone pulses, typical for a female in diestrus, were observed, showing low basal luteinizing hormone levels. An immediate and robust increase in luteinizing hormone was detected in response to Kisspeptin administration.