Bu protokol sensör ve motor fibroblast ve Schwann hücrelerinin hızla çok sayıda elde etmek için kullanılabilir. Bu mesaj la elde edilen hücreler sinir rejenerasyonu ve sinir sistemi hastalıkları nın incelenmesinde kullanılabilir. Diferansiyel sindirim adımının zamanını daha iyi kontrol etmek ve deneysel adımların anlaşılmasını kolaylaştırmak için deneyselliği temsil edebileceğimizi gösteriyoruz.
Patlamak için arka deride üç santimetrelik bir kesi yapmak için makas kullanın. Omuriliği çıkar. Omuriliği ortaya çıkarmak için vertebrakanalını dikkatlice açın.
Bir 60 milimetre Petri çanak içinde omurilik Dantel, buz soğuk D Hanks bir diseksiyon mikroskop altında tuz çözeltisi dengeli üç ila dört mililitre ile, ventral kök ve dorsal kök çıkarmak. Buz soğuk D Hanks dengeli tuz çözeltisi yerleştirin. HBSS çıkardıktan sonra, makas ile, üç ila beş milimetrelik parçalar halinde sinirlerdilim.
0.25% tripsin bir mililitre ekleyin ve beş mililitre santrifüj tüpler için sinir parçaları aktarın. 37 derecede 18-20 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, sindirimi durdurmak için, % 10 fetal sığır serumu içeren DMEM üç ila dört mililitre ekleyin.
Pipet karışımı yukarı ve aşağı yavaşça yaklaşık 10 kez. 5 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın.
Ve dmem 2-3 mililitre% 10 FBS ile takviye çökelti yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 400 örgü filtresinden süzün ve ardından 60 milimetrelik Petri kabını aşılamak için süspansiyonu kullanın. Petri tabaklarını %5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede 4-5 gün kuluçkaya yatırın.
Kültür %90 birleştiğinde, hücreleri 1XPBS kullanarak bir kez yıkayın. Sonra, Schwann hücreleri sindirmek için, 60 milimetre çanak başına 37 santigrat derece 0.25% tripsin bir mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında sekiz ila 10 saniye sonra, sindirimi durdurmak, DMEM üç mililitre ekleyerek 10% FBS ile takviye.
Schwann hücrelerini ayırmak için, yavaşça bir pipet ile hücre üzerinde darbe. Hücrelerin ayrı olduğunu mikroskopla doğrulayın. Sonra Kuğu hücreleri içeren orta toplamak ve beş dakika boyunca 800 kez G santrifüj.
Supernatant atın ve orta üç mililitre çökelti yeniden askıya. Kaplamasız 60 milimetre Petri tabaklarını aşılamak için bu süspansiyonu kullanın ve 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika boyunca bulaşıkları kuluçkaya yatırın. Bir Poly L lizin kaplı orta çanak Schwann hücreleri içerecek ve iki gün boyunca 37 derece santigrat de çanak kuluçka orta için markalar.
Schwann hücreleri içeren orta çıkardıktan sonra 1XPBS ile Petri yemekleri yapışarak, fibroblastlar yıkayın. Fibroblastları sindirmek için, 37 santigrat derecede bir mililitre 0.25% tripsin ekleyin. 37 santigrat derece iki dakika devam etmek için sindirim izledikten sonra, DMEM ekleyerek sindirimi sona erdirmek 10% FBS ile takviye.
Fibroblastlar ayırmak için, çanak alt darbe için bir pipet kullanın. Fibroblastlar da dahil olmak üzere orta toplamak ve santrifüj tüplere aktarın. Tüpleri 800 kez G'de beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve% 10 FBS içeren DMEM iki mililitre ile çökelti yeniden askıya. Hücreleri kodlanmamış, 60 milimetre, Petri kapları ve 37 derecede 30 ila 45 dakika kuluçkaya yatırın. Büyüme ortamını çıkararak ve atarak Petri kaplarına yapışacak fibroblastları izole edin.
DMEM üç mililitre ekleyin 10% FBS ile tamamlanır. 37 derecede iki gün boyunca bir hücre %90'a ulaşana kadar kuluçkaya yat. Diferansiyel sindirimi ve bağlılığı tekrarlayın.
İki gün boyunca fibroblastlar ve Schwann hücrelerine geçiş kültürden sonra, hücreleri sindirmek, onları toplamak ve onları saymak. ICC boyama için iyi başına bu hücrelerin bir kez 10 konsantrasyonda PLL kaplı slaytlar aşılamak. Bay kontrast mikroskopisi izolasyon süreci boyunca kültürlü Schwann hücrelerinin ve fibroblastların morfolojisini gösterir.
Uzun bir kültür süresinden sonra Schwann hücreleri fibroblastlar arasında veya fibroblastların yüzeyinde bir araya getirildi. 10 saniye sindirimi nden sonra, kırmızı oklarla gösterilen Schwann hücreleri yuvarlaktı, fibroblastlar düz kalırken ve yemeğin dibine bağlıydı. Diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık ile izolasyon sonrası dört hücre tipinde de tipik hücre morfolojileri gözlendi.
Motor fibroblastlar, duyusal fibroblastlar, motor Schwann hücreleri ve duyusal Schwann hücreleri. Duyusal ve motor fibroblastlar koni odak lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Fibroblastlar hücre çekirdeğini etiketlemek için CD 90 X33342 boyasına karşı antikorlarla boyandı.
Fibroblastların immünboyama ve nükleer boyama ile birleştirilmiş görüntüleri, cd 90 ve hexed ortak etiketli hücrelerin%92.51 ve %92.64'ünün motor ve duyusal fibroblastlarda bulunduğunu göstermiştir. Duyusal ve motor Schwann hücreleri konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Schwann hücreleri s100 X33342 boya karşı antikorlar ile boyanmış hücre çekirdekleri etiketlemek için kullanılmıştır.
Kuğu hücre immünboyama ve nükleer boyama birleştirme görüntüleri sırasıyla, motor ve duyusal Schwann hücrelerinde% 91.61 ve% 93.56 S100 varlığını gösterdi ve hexed co-etiketli hücreler, sırasıyla. Hücre saflığı da akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Fibroblast kültürlerinde hücrelerin yaklaşık %90'ı fibroblastlar, FCA grafiklerinde M2 ile gösterilirken, geri kalan hücreler Schwann hücreleridir.
Schwann hücre kültürlerinde hücrelerin %92'den fazlası Schwann hücreleriydi, fca grafiklerinde m2 ile gösterilirken, geri kalan hücreler fibroblastlardı. Bu protokol nadiren sensör ve fibroblastların motor sinir rejenerasyon mekanizması başlatmak için yararlıdır, ve Schwann hücreleri nakli, sinir rejenerasyonu teşvik etmek.
