Yazarlar, yıllar içinde bu teknikleri etkileyen/geliştiren bilgi ve mentorluk soyunu kabul etmek istemektedir. Eski bir yüksek lisans öğrencisi, doktora sonrası ve şu anki profesör olarak Dr. Hamilton-Brehm, anaerobik teknikleri öğretmek için zaman ayıranlara şükran borçludur: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser ve Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy ve American Rivers, bu çalışmayı sırasıyla G21-026-CON-P ve AR-CE21GOS373 hibeleriyle destekledi. Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya tavsiye yazarlara aittir ve Nature Conservancy veya American Rivers'ın görüşlerini yansıtmayabilir. Bu çalışma, Gelişmiş Enerji Kaynakları Kurulu aracılığıyla verilen finansmanı minnetle kabul eden SIU Gelişmiş Enerji Enstitüsü'nden bir hibe ile desteklenmiştir. NGS, LC Sciences tarafından gerçekleştirilmiştir.

Çevresel mikropların kültürlenmesi için yerinde simüle edilmiş anaerobik yöntem

<ol>
	<li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats.">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li><li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes.">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055 (2018).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+biological+&amp;#34;dark+matter&amp;#34;+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth.">Dissecting biological &amp;#34;dark matter&amp;#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li><li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the'omics'+age.">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands:+Knowledge+gained+and+remaining+gaps.">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184 (2011).</li><li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating&amp;#34;+uncultivable&amp;#34;+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment.">Isolating&amp;#34; uncultivable&amp;#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012 (2011).</li><li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community.">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li><li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogens:+Reevaluation+of+a+unique+biological+group.">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li><li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow.">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).</li><li>. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013)</li><li>. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018)</li><li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a~+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer.">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).</li><li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li><li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes.">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.,+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin.">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.,+an+anaerobic,+extremely+thermophilic,+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.,+a+hyperthermophilic,+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li><li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin.">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokolün orta üretim bölümü (bölüm 1) yapısını, yayınlanmasından bu yana yaygın olarak kullanılan Miller ve Wolin17'nin değiştirilmiş Hungate tekniğine borçludur. Bu genişletilmiş protokolün pratikliği, tanımlayıcı doğasından ve mikroorganizmaların yerinde edinilmesiyle eşleşmesinden kaynaklanmaktadır. Çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş ortam içeren kültür şişeleri, "mikrobiyal karanlık maddenin" yerinde edinilmiş eski üyele...

Çoğu mikroorganizma kültürlenmemiş olarak kalır; Bu, agar plakaları kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenen birkaç mikroorganizmanın aksine, mikroskopi ile gözlemlenen hücreler arasındaki büyük eşitsizlik ile desteklenir. Staley ve Konopka bu eşitsizliği "Büyük Plaka Sayısı Anomalisi" olarak adlandırdılar1. Tahmini hesaplanmamış çeşitlilik, birkaç farklı ortamdan sıra bolluk eğrilerinde dağılmış birçok yeni cinsi gösteren metagenomik ve metatranskriptomik verilerle desteklenmektedir2. Gözlemlenen mikroorganizmalar (genellikle bir mikrobiyal topluluğun rastgele av tüfeği dizilimi ile) ancak kültürlenmemiş "mikrobiyal karanlık madde" olarak adlandırılmıştır3,4.
-Omik çağında, genomik verileri tam olarak değerlendirmek ve mevcut genlerin işlevini/fenotipini doğrulamak için mikroorganizmaların kültürlenmesi zorunludur. Kültürlenmiş mikroorganizmaların dizilenmesi, av tüfeği metagenomikleri ve çevreden metagenomla birleştirilmiş genomlar gibi teknolojiler kabul edilebilir bir şekilde yanılmaz hale gelene kadar tam genomları güvenle elde etmenin tek yoludur5. Kültürlenmiş mikroorganizmalarla birleştirilmiş genomik değerlendirmeler, "mikrobiyal karanlık maddeyi" anlamak için güçlü çıkarımlar sağlar. "Mikrobiyal karanlık maddenin" birçok üyesi, besinlerin ve diğer elementlerin döngüsünü ve değerli doğal ürünlerin üretimini etkileyen, ekolojik sistemleri destekleyen ve ekolojik hizmetleri yerine getiren önemli işlevleri yerine getirir. Tıbbi açıdan bakıldığında, şu anda pazarlanan tüm ilaçların yaklaşık yarısı, bakterilerden elde edilen ürünlerin ürünleri ve türevleridir ve kültürlenmemiş türlerin profillenmesinin geleceğin antibiyotiklerini ortaya çıkardığından şüphelenilmektedir. Bu kültürsüz çoğunluğa erişmek için, çeşitli kültür metodolojileri artırılmalıdır6. "Mikrobiyal karanlık madde" üyeleri arasında, anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar büyük ölçüde rapor edilmemiştir ve muhtemelen ekolojik ve endüstriyel olarak değerli biyokimyasal yollara7 sahiptir, bu da onları kültürlemenin önemli hedefleri haline getirir. Bununla birlikte, anaerobik oligotrofik mikroorganizmaların kültürlenmesi, genellikle gerekli olan daha uzun inkübasyon süreleri, titiz koşullar (örneğin, belirli standart dışı in vitro sıcaklıklar) ve özel ortam tariflerinin kullanımı nedeniyle aerobik ve kopiotrofik muadillerine göre daha zordur.
Yeni anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar da dahil olmak üzere "mikrobiyal karanlık madde" üyelerini kültürlemek için mevcut gelişen teknikler, anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi ve bu mikroorganizmaların filogenetik ağaç içindeki temsilini artırdı. Yeni mikroorganizmaların kültürlenmesi için bilgilendirilmiş ortam kullanan mevcut teknikler (yani, ilgilenilen mikroorganizma/organizmaların bilgisi kullanılarak türetilen ortam) üç farklı yönteme ayrılabilir. Yöntemlerden ilki, bir zar içinde ilgilenilen mikroorganizmaları zaten içeren bir in vitro büyüme odasına transfer için ortamın ayrı bir bölümünün doğrudan çıkarılmasını gerektirir. Ayrık bölüm (örneğin, deniz suyu), ilgilenilen mikroorganizmalara yerinde kullandıkları jeokimyasal habitatı sağlamak için hareket ederken, zar hücrelerin hareketini durdurur (ilgilenilen hücreler içeride kalacaktır; ayrık bölümle gelen yabancı hücreler dışarıda kalacaktır). Mikroorganizmaları doğal ortamlarında hedeflemek için doğal olarak bulunan bileşikleri dahil ederek, bu tür mikroorganizmalar kültürlenebilir8. İkinci yöntem, metabolik yetenekleri aydınlatmak için metatranskriptomik veya genomik kullanır ve hedeflenen bir ortam tasarımı için dar kültür parametrelerine ipuçları sağlar. Bu yaklaşım, belirli mikroorganizma türlerinin bir ortamdan zenginleştirilmesini hedeflemek için kullanılabilecek eko-fizyolojik bir profil sağlar. Ortamın hükümleri, zenginleştirme çeşitliliğini azaltmak için hedeflenen mikroorganizma(lar)ı desteklediği varsayılan mevcut tanımlanmış genlere yöneliktir,9,10. Bir uyarı, genomik bilginin genlerin ekspresyonunu doğrudan anlamadığı, transkriptomik bilginin ise çıkardığıdır.
Üçüncü yöntem, medyayı simüle etmeyen, bunun yerine çevreyi doğrudan bir medya kaynağı olarak kullanan birinci yöntemden farklı olarak, çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş medyayı kapsar. Bu üçüncü yöntem, ilgilenilen mikroorganizmaları içeren bir saha sahasının jeokimyasının çevresel keşfini gerektirir. Bu bilgiyle, çevresel olarak bilgilendirilmiş simüle edilmiş bir ortam üretmek için birincil bileşenler ve fiziksel parametreler tanımlanır. Ortam daha sonra ortamdan ortama mikroorganizma içeren tortu veya sıvının doğrudan infüzyonunu alır. Bu yöntem, kültür mikrobiyoloğunun yeterli miktarda kaynak ortama (ilk yöntem için gerektiği gibi) veya uygun metatranskriptomik veya genomik verilere (ikincisi için gerektiği gibi) erişiminin olmadığı durumlarda özellikle değerlidir.
Aşağıdaki protokol üçüncü yönteme bir örnektir; İlgilenilen ortamlar tarafından bilgilendirilir ve simüle etmeyi amaçlar. Protokol kapsamında, sahada elde edilen farklı anaerobik mikroorganizma kültürlerini hedef alan üç naif besiyeri reçetesi paralel olarak sunulmaktadır. Temsil edilen üç kültür, topraktan kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra toprak karışık kültür olarak anılacaktır), bir sondaj deliğinden kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra sondaj deliği karışık kültürü) ve bir sondaj deliğinden kaynaklanan izole edilmiş bir metanojendir (bundan sonra, sondaj deliği izole metanojen). Burada paylaşılan medya tariflerinde yer alan bileşik kimlikler ve miktarlar bir başlangıç rehberi niteliğindedir; Okuyucunun çevresine ve ilgilendiği mikroorganizmalara göre özelleştirilebilir ve teşvik edilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L borosillicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with slip tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL culture bottle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mm hand crimper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 31.5 cm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 6 cm length</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corer</td>
			<td>Giddings Machine Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from company parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas manifold</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from many different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for GL45 bottles)</td>
			<td>Glasgeratebau OCHS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for culture bottles)</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace minerals</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor-specific Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 rubber stopper</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 rubber stopper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; hose barb ball valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/16&#34; - 1/4&#34; hose barb adapter fitting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 L borosillicate carboy</td>
			<td>Allen Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balloon</td>
			<td>Party City</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate bioreactor</td>
			<td>Allen Scientific Glass</td>
			<td></td>
			<td>Custom made upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer lock adapter coupler</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL45 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand chain clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 1/4&#34; id, 1/2&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55YG13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 3/16&#34; id, 3/8&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low flow variable flow mini-pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White rubber septum for 13-18 mm od tubes</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>9096-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip tie</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a set of in situ informed simulated medium formats for culturing environmentally acquired anaerobic microorganisms

Anaerobik mikroorganizmaların kültüre bağlı araştırmaları metodolojik yeterliliğe dayanır. Bu yöntemler, anaerobik mikroorganizmalar için uygun büyüme koşulları (örneğin, pH ve karbon kaynakları) yaratmalı ve sürdürmeli, aynı zamanda yapay ortamdan ödün vermeden numunelerin ekstrakte edilmesine izin vermelidir. Bu amaçla, yerinde bir ortam tarafından bilgilendirilen ve simüle edilen yöntemler, o ortamdan mikroorganizmaların kültürlenmesinde çok yardımcı olabilir. Burada, minimum bozulma ile anaerobik numune toplamayı vurgulayarak, karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmaların kültürlenmesi için yerinde bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş bir anaerobik yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, özelleştirilebilir bir anaerobik sıvı ortamın üretimini ve anaerobik mikroorganizmaların çevresel edinimini ve in vitro büyümesini detaylandırır. Protokol ayrıca, çevresel olarak edinilen kültürler için tortu ve anaerobik sıvı ortamın çevresel simülasyonları için kullanılan bir anaerobik biyoreaktörün kritik bileşenlerini de kapsar. Aktif kültürün deneysel bir karbon kaynağına yanıt olarak dinamik olarak ayarlandığı bir biyoreaktörün ömrü boyunca korunan bir mikrobiyomdan elde edilen ön Yeni Nesil Dizileme verilerini dahil ettik.

Most microorganisms remain uncultured; this is supported by the great disparity between cells observed through microscopy contrasted by the few microorganisms successfully cultured using agar plates. Staley and Konopka named this disparity the &#34;Great Plate Count Anomaly&#34;1. The estimated unaccounted diversity is supported by metagenomic and metatranscriptomic data showing many novel genera distributed in rank abundance curves from several different environments2. Microorganisms that have been observed (generally by random shotgun sequencing of a microbial community) but have not been cultured have been referred to as &#34;microbial dark matter&#34;3,4.
In the age of -omics, culturing microorganisms remains imperative to fully evaluate genomic data and verify the function/phenotype of genes present. Sequencing cultured microorganisms is still the only way to confidently obtain complete genomes until technologies such as shotgun metagenomics and metagenome-assembled genomes from the environment become admissibly infallible5. Genomic evaluations coupled with cultured microorganisms provide strong inferences for understanding &#34;microbial dark matter.&#34; Many members of the &#34;microbial dark matter&#34; perform crucial functions that impact the cycling of nutrients and other elements and the production of valuable natural products, support ecological systems, and perform ecological services. From the medical perspective, about half of all currently marketed pharmaceuticals are products and derivatives of products from bacteria, and profiling uncultured species is suspected to reveal the antibiotics of the future. To gain access to this uncultured majority, a variety of culturing methodologies must be increased6. Among the members of the &#34;microbial dark matter,&#34; anaerobic oligotrophic microorganisms are largely underreported and likely hold ecologically and industrially valuable biochemical pathways7, making them important targets of culturing. However, anaerobic oligotrophic microorganisms are more difficult to culture than their aerobic and copiotrophic counterparts due to often-required longer incubation times, fastidious conditions (e.g., particular non-standard in vitro temperatures), and the use of specialized media recipes.
Current developing techniques to culture members of the &#34;microbial dark matter,&#34; including novel anaerobic oligotrophic microorganisms, have greatly improved our understanding and increased the representation of these microorganisms within the phylogenetic tree. Current techniques using informed media for culturing novel microorganisms (i.e., media which is derived using knowledge of the microorganism/s of interest) can be separated into three distinct methods. The first of the methods entails the direct removal of a discrete section of the environment for transfer into an in vitro growth chamber that already contains the microorganisms of interest within a membrane. The discrete section (e.g., seawater) acts to provide the microorganisms of interest with the geochemical habitat they use in situ, while the&#160;membrane arrests the movement of cells across (cells of interest will remain within; extraneous cells that arrived with the discrete section will remain without). By including compounds naturally available to target microorganisms in their natural habitat, such microorganisms can be cultured8. The second method utilizes metatranscriptomics or genomics to elucidate metabolic capabilities, providing clues to narrow culturing parameters for a targeted medium design. This approach provides an eco-physiological profile that can be used to target the enrichment of specific types of microorganisms out of an environment. The medium&#39;s provisions are catered to the identified genes present that are presumed to support the targeted microorganism(s) to reduce enrichment diversity,9,10. One caveat is that genomic information does not directly infer the expression of genes, while transcriptomic information does.
The third method encompasses environmentally informed and simulated media, distinct from the first method, which does not simulate the media but rather uses the environment directly as a source of media. This third method requires environmental reconnaissance of the geochemistry of a field site containing microorganisms of interest. With this knowledge, primary components and physical parameters are identified to produce an environmentally informed simulated medium. The medium then receives a direct infusion of microorganism-containing sediment or liquid from the environment into the medium. This method is of particular value in cases where the culturing microbiologist does not have access to sufficient quantities of source environment (as needed for the first method) nor appropriate metatranscriptomic or genomic data (as needed for the second).
The following protocol is an example of the third method; it is informed by and aims to simulate environments of interest. Three na&#239;ve media recipes targeting different anaerobic microorganism cultures acquired in the field are presented in parallel within the protocol. The three cultures represented are mixed cultures originating from soil (hereafter, soil mixed culture), mixed cultures originating from within a borehole (hereafter, borehole mixed culture), and an isolated methanogen originating from within a borehole (hereafter, borehole isolated methanogen). The compound identities and amounts in the media recipes shared here are meant as a beginning guide; they are able and encouraged to be customized to the reader&#39;s environment and microorganisms of interest.

Yazar Spotlight: Yerinde Kültürleme ile Keşfedilmemiş Ortamlarda Karasal Anaerobik Mikroorganizmaların Gizemlerini Çözmek

Çevresel Olarak Edinilmiş Anaerobik Mikroorganizmaların Kültürlenmesi için Bir Dizi Yerinde Bilgilendirilmiş Simüle Edilmiş Ortam Formatı

Our research focuses on terrestrial surface and subsurface microorganisms, culturing them and investigating their genomes and phenotypes. Of particular focus are microorganisms in environments that are not well understood, like those in the deep subsurface and in certain wetlands. Most of the microorganisms we culture are anaerobic, which means the culturing process generally requires more time and attention than processes for more commonly-used aerobic microorganisms.We hope the audiovisual presentation of anaerobic medium preparation will help researchers new to the technique learn it relatively quickly and easily. This medium preparation is based on the modified Hungate technique of Miller and Wolin. Culturing fastidious microbes is tedious and problematic.Having more tools to grow them is very welcome to the scientific community. Future research in general will be similar to our current research of understudied terrestrial microorganisms. There are still many new microbes to discover and study.

Burada, burada açıklandığı gibi bir sondaj deliği karışık kültür ortamı hazırlama yöntemi ve bir biyoreaktör kurulum yöntemi kullanan bir biyoreaktör çalışmasının sonuçlarını gösteriyoruz. Sondaj deliği karışık kültür ortamı, bir karbon kaynağı olarak Oksidatif Hidrotermal Çözünme (OHD) 13,14 ile işlenmiş bir mısır koçanı bulamacı içerecek şekilde modifiye edildi. Modifiye edilmiş sondaj deliği karışık kültür ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Unraveling the Mysteries of Terrestrial Anaerobic Microorganisms in Uncharted Environments by In Situ Culturing at JoVE.com

Bu makalenin odak noktası, bir ortamdan elde edilen titiz anaerobik mikroorganizmalar için ortam yapmak için en iyi uygulamaları detaylandırmaktır. Bu yöntemler anaerobik kültürlerin yönetilmesine yardımcı olur ve "mikrobiyal karanlık madde" olarak adlandırılan, kültürlenmemiş mikroorganizmaların büyümesini desteklemek için uygulanabilir.

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Araştırmalarımız karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmalarına, onları kültürlemeye ve genomlarını ve fenotiplerini araştırmaya odaklanmaktadır. Özellikle odak noktası, derin yeraltındakiler ve bazı sulak alanlardakiler gibi iyi anlaşılmayan ortamlardaki mikroorganizmalardır. Kültürlediğimiz mikroorganizmaların çoğu anaerobiktir, bu da kültürleme işleminin genellikle daha yaygın olarak kullanılan aerobik mikroorganizmalar için işlemlerden daha fazla zaman ve dikkat gerektirdiği anlamına gelir.Anaerobik ortam hazırlığının görsel-işitsel sunumunun, tekniğe yeni başlayan araştırmacıların nispeten hızlı ve kolay bir şekilde öğrenmelerine yardımcı olacağını umuyoruz. Bu orta preparat, Miller ve Wolin'in modifiye edilmiş Hungate tekniğine dayanmaktadır. Titiz mikropları kültürlemek sıkıcı ve sorunludur.Onları büyütmek için daha fazla araca sahip olmak, bilim camiasına çok hoş geldiniz. Genel olarak gelecekteki araştırmalar, az çalışılmış karasal mikroorganizmalar hakkındaki mevcut araştırmalarımıza benzer olacaktır. Hala keşfedilecek ve incelenecek birçok yeni mikrop var.

a-set-situ-informed-simulated-medium-formats-for-culturing

Research

JoVE Journal

Environment

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

434 Görüntüleme.  Southern Illinois University Carbondale. Araştırmalarımız karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmalarına, onları kültürlemeye ve genomlarını ve fenotiplerini araştırmaya odaklanmaktadır. Özellikle odak noktası, derin yeraltındakiler ve bazı sulak alanlardakiler gibi iyi anlaşılmayan ortamlardaki mikroorganizmalardır. Kültürlediğimiz mikroorganizmaların çoğu anaerobiktir, bu da kültürleme işleminin genellikle daha yaygın olarak kullanılan aerobik mikroorganizmalar için işlemlerden daha fazla zama...

Video: Yazar Spotlight: Yerinde Kültürleme ile Keşfedilmemiş Ortamlarda Karasal Anaerobik Mikroorganizmaların Gizemlerini Çözmek

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth conditions (e.g., pH and carbon sources) for anaerobic microorganisms while also allowing samples to be extracted without compromising the artificial environment. To this end, methods that are informed by and simulate an in situ environment can be of great aid in culturing microorganisms from that environment. Here, we outline an in situ informed and simulated anaerobic method for culturing terrestrial surface and subsurface microorganisms, emphasizing anaerobic sample collection with minimal perturbation. This protocol details the production of a customizable anaerobic liquid medium, and the environmental&#160;acquisition and in vitro growth of anaerobic microorganisms. The protocol also covers critical components of an anaerobic bioreactor used for environmental simulations of sediment and anaerobic liquid media for environmentally acquired cultures. We have included preliminary Next Generation Sequencing data from a maintained microbiome over the lifespan of a bioreactor where the active culture dynamically adjusted in response to an experimental carbon source.

The focus of this paper is to detail best practices for making media for fastidious anaerobic microorganisms acquired from an environment. These methods help manage anaerobic cultures and can be applied to support the growth of elusive uncultured microorganisms, the "microbial dark matter."