Daha spesifik protein-protein etkileşimlerinde amino asit tercihlerinin hesaplamalı tahmini için bir protokol öneriyoruz. Bu protokol, bu etkileşimlerin aracılarının tasarımında ilk adım olarak düşünülebilir. Bu aracıları, immünoloji teknoloji uzmanında spesifik etkileşimlerin potansiyel inhibitörleri olarak kullanmakla ilgileniyoruz.
Spesifik bağlanma bölgeleri arasındaki amino asit tercihlerini karakterize etmek için kullanılan uygulayıcımız pahalı ve hantaldır. Protokolümüz, verimlilik ve seri işlemlere dayalı biyo-destekli bir teknolojidir. Bu strateji, amino asit tercihlerinde tam ve tutarlı bir fark sağlayarak çok sayıda çizgi dizisini işleme potansiyeline sahiptir.
Protokolümüz, tipik olarak sınırlı sayıda diziden, web laboratuvarı yaklaşımlarındaki işlemlerden daha eksiksiz bir diziye tercih edilen çok sayıda DNA dizisini işleyerek profesyonel bir maliyet etkin sunar. İmmünolojik ürünlerin inhibitörlerinin geliştirilmesine ek olarak, bu metodolojinin performansını diğer ürün aileleriyle karşılaştırmak istiyoruz. Bu, yalnızca immünolojik bağlamda değil, aynı zamanda sinyalleşme ve iletişim gibi diğer hücresel işlevlerde de çoklu özgüllüğün yapısal temelini daha iyi anlamamızı sağlayacaktır.
Protein-protein kompleksinin yapısını indirerek başlayın. Bunun için protein veri bankası ana sayfasına gidin ve ana arama kutusuna PDB ID'yi girin. Yapının ana sayfasında, Dosyaları İndir'e ve ardından dosyaları PDB gz formatında indirmek için Biyolojik Montaj 1'e tıklayın.
İndirilen yapıyı UCSF Chimera'da açın. Araçlar'a, ardından Yapı Düzenleme'ye gidin ve Zincir Kimliklerini Değiştir'e tıklayın. Başlangıçta A olarak etiketlenen ikinci zinciri B olarak yeniden adlandırın.Ardından, Sık Kullanılanlar'a ve ardından Model Paneli'ne tıklayın.
İki zincirli modeli seçin ve her zinciri farklı bir modele ayırmak için grupla/grubu çöz düğmesine tıklayın. Ardından, iki modeli seçin ve kopyala/birleştir düğmesine tıklayın. Birleştirilmiş model için yeni bir ad girin.
Close source models (Kaynak modellerini kapat) seçeneğini işaretleyin ve OK (Tamam) düğmesini tıklatın. Seç'e, ardından Zincir'e tıklayın ve dimerdeki zincirlerin artık A ve B olarak tanımlandığını onaylayın.Düzenlenen yapıyı yeni bir PDB dosyası olarak kaydetmek için Dosya'ya tıklayın ve PDB'yi kaydedin. Ligand proteinindeki hedef segmenti belirlemek için BUDE Alanine Scan sunucusuna gidin. Yapı Yükleme altındaki Dosya Seç düğmesine tıklayın ve kaydedilen PDB dosyasını yükleyin.
Sonraki sayfada, yapının doğru şekilde yüklenip yüklenmediğini kontrol edin ve sunucudaki iş için bir ad girin. A zincirlerini Reseptör ve B zincirlerini Ligand olarak ayarlayın ve işi göndermek için Taramayı Başlat düğmesine tıklayın. İş bittiğinde, Sonuçlar sayfasını açmak için Sonuçları Göster'e tıklayın.
Kalıntı listesinden, hedef bağlama yüzeyi ile daha iyi etkileşime gireceği tahmin edilen kalıntı gerginliğini seçin. Bu protokol ve amino asit segmenti kullanılarak, IRF5 bağlanma yüzeyi ile etkileşime girdiği tahmin edildi. Hesaplamalı alanin tarama mutajenezi kullanılarak, 424 ila 436 pozisyonlarından 13 amino asitlik bir segment tahmin edildi ve p L x IS motifi arginin 432'de başladı.
Başlamak için, dizi çeşitlendirmesi için protein peptit arayüzünü hazırlayın. PDB dosyasını Chimera'da açın ve hedef alt birimlerin yapısının sağlam olduğundan ve eksik atom veya bağ olmadığından emin olun. Esansiyel olmayan tüm molekülleri yapıdan çıkarmak için Seç'e ve ardından Kalıntılar'a tıklayın ve ardından standart amino asitler dışındaki tüm molekülleri seçin.
Ardından Eylemler'e ve ardından Adams/Bonds'a tıklayın ve silin. Ardından, Sırayla Sık Kullanılanlar'a tıklayın ve ardından ligand olarak kabul edilen zincire tıklayın. Seçilen konumlar arasındakiler dışındaki tüm kalıntıları silerek ligand zincirini tanımlanan etkileşimli segmente kırpın.
Düzenlenen yapıyı farklı bir PDB dosyasına kaydetmek için Dosya ve PDB'yi kaydet'e tıklayın. Bu dosyayı Rosetta uygulamaları tarafından erişilebilen bir Linux konumuna kopyalayın. Bu komutu çalıştırarak, dizi çeşitlendirmesinden önce baz yapısının tüm amino asit yan zincirlerinin yeniden paketlenmesini gerçekleştirmek için Rosetta'nın fixedbb uygulamasını kullanın.
Ardından, aşağıdaki komutu kullanarak yeniden paketleme PDB dosyasını bir _ yeniden paketleme sonekiyle yeniden adlandırın. Ardından, bu komutu kullanarak dizi çeşitlendirmesi gerçekleştirmek için pepspec'i tasarım modunda çalıştırın. Ardından, gen pepspec pwm kullanarak bir pwm oluşturun.
py betiği Rosetta paketine dahildir. Bu komut dosyasını çalıştırmak için aşağıdaki komutu kullanın. Bir dizi logosu oluşturmak için, önceki adımda oluşturulan peptit dizilerinin bulunduğu dosyayı tercih edilen bir metin düzenleyiciyle açın ve tüm dizileri kopyalayın.
WebLogo sunucusuna gidin ve dizileri Çoklu Dizi Hizalama metin kutusuna yapıştırın. Giriş uzunluğuna göre logonun istediğiniz biçimini ve boyutunu seçin ve Logo Oluştur'a tıklayın. Bu protokol kullanılarak, IRF5 bağlanma yüzeyindeki korunmuş p L x IS motifi için amino asit tercihleri tahmin edildi.
Dizi çeşitlendirmesi üzerine oluşturulan konum, ağırlık matrisi ve dizi logosu, 432 pozisyonunda glutamat ve 433 ve 435 pozisyonlarında lösin ve izolösin tercihi gösterdi. Tipik olarak Serin tarafından işgal edilen 427, 429 ve 436 pozisyonları, aspartat ve glutamat için daha yüksek bir tercih gösterdi ve fosforilasyon ve IRF5 dimerizasyonunun rolünü vurguladı. Pozisyon 425, Serin için yüksek bir tercih gösterdi, bu da fosforile edilmemiş formunda protein-protein etkileşimine dahil olduğunu düşündürdü.
