우리는 보다 구체적인 단백질-단백질 상호 작용에서 아미노산 선호도의 컴퓨터 예측을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜은 이러한 상호 작용의 매개자 설계의 첫 번째 단계로 간주될 수 있습니다. 우리는 면역학 기술자에서 이러한 매개체를 특정 상호 작용의 잠재적 억제제로 사용하는 데 관심이 있습니다.
특정 결합 부위 간의 아미노산 선호도를 특성화하는 데 사용되는 구현자는 비용이 많이 들고 번거롭습니다. 당사의 프로토콜은 효율성과 직렬 작동을 기반으로 하는 바이오 기반 기술입니다. 이 전략은 많은 수의 라인 염기서열을 처리할 수 있는 잠재력을 가지고 있어 아미노산 선호도의 완전하고 일관된 차이를 제공합니다.
당사의 프로토콜은 웹 랩 접근 방식에서 일반적으로 제한된 수의 염기서열, 프로세스 중에서 더 완전한 것보다 선호되는 많은 수의 DNA 염기서열을 처리함으로써 전문적이고 비용 효율적인 기능을 제공합니다. 면역학 제품의 억제제 개발 외에도 이 방법론의 성능을 다른 제품군과 비교하고자 합니다. 이를 통해 우리는 면역학적 맥락뿐만 아니라 신호 전달 및 의사 소통과 같은 다른 세포 기능에서도 다중 특이성의 구조적 기초를 더 잘 이해할 수 있습니다.
단백질-단백질 복합체의 구조를 다운로드하는 것으로 시작합니다. 이를 위해 단백질 데이터 뱅크 홈페이지로 이동하여 기본 검색 상자에 PDB ID를 입력합니다. 구조의 기본 페이지에서 Download Files를 클릭한 다음 Biological Assembly 1을 클릭하여 PDB gz 형식의 파일을 다운로드합니다.
다운로드한 구조를 UCSF Chimera에서 엽니다. Tools(도구)로 이동한 다음 Structure Editing(구조 편집)으로 이동하여 Change Chain IDs(체인 ID 변경)를 클릭합니다. 처음에 A로 레이블이 지정된 두 번째 체인의 이름을 B로 바꾼 다음 즐겨찾기를 클릭한 다음 모델 패널을 클릭합니다.
두 개의 체인이 있는 모델을 선택하고 그룹/그룹 해제 버튼을 클릭하여 각 체인을 다른 모델로 분리합니다. 그런 다음 두 모델을 선택하고 복사/결합 버튼을 클릭합니다. 결합된 모델의 새 이름을 입력합니다.
Close source models(소스 모델 닫기)를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다. 선택을 클릭한 다음 체인을 클릭하고 이량체의 체인이 이제 A 및 B로 식별되었는지 확인합니다. 파일을 클릭하고 PDB를 저장하여 편집된 구조를 새 PDB 파일로 저장합니다. 리간드 단백질의 표적 세그먼트를 식별하려면 BUDE Alanine Scan 서버로 이동합니다. Structure Upload(구조 업로드)에서 Choose File(파일 선택) 버튼을 클릭하고 저장된 PDB 파일을 업로드합니다.
다음 페이지에서 구조체가 올바르게 로드되었는지 확인하고 서버의 작업 이름을 입력합니다. 체인 A를 Receptor로, B를 Ligand로 설정하고 Start Scan(스캔 시작) 버튼을 클릭하여 작업을 제출합니다. 작업이 완료되면 Show Results(결과 표시)를 클릭하여 Results(결과) 페이지를 엽니다.
Residue 목록에서 타겟 결합 표면과 더 잘 상호 작용할 것으로 예측되는 잔류물의 스트레치를 선택합니다. 이 프로토콜과 아미노산 세그먼트를 사용하여 IRF5 결합 표면과 상호 작용하는 것이 예측되었습니다. 전산 알라닌 주사 돌연변이 유발을 사용하여 위치 424에서 436까지 13개의 아미노산 세그먼트를 예측했으며, p L x IS 모티프는 아르기닌 432에서 시작했습니다.
먼저 염기서열 다양화를 위해 단백질 펩타이드 계면을 준비합니다. Chimera에서 PDB 파일을 열고 대상 소단위의 구조가 누락된 원자 또는 결합 없이 손상되지 않았는지 확인합니다. 구조에서 필수적이지 않은 모든 분자를 제거하려면 Select (선택)를 클릭한 다음 Residues(잔류물)를 클릭한 다음 표준 아미노산 이외의 모든 분자를 선택합니다.
그런 다음 Actions(작업)를 클릭하고 Adams/Bonds를 클릭하고 삭제합니다. 그런 다음 Favorites, in Sequence를 클릭한 다음 리간드로 간주되는 사슬을 클릭합니다. 선택한 위치 사이의 잔기를 제외한 모든 잔기를 삭제하여 식별된 상호 작용 세그먼트로 리간드 사슬을 자릅니다.
파일을 클릭하고 PDB를 저장하여 편집된 구조를 다른 PDB 파일에 저장합니다. 이 파일을 Rosetta 응용 프로그램에서 액세스할 수 있는 Linux 위치에 복사합니다. Rosetta의 fixedbb 응용 프로그램을 사용하여 다음 명령을 실행하여 염기서열 다양화 전에 염기 구조의 모든 아미노산 측쇄를 재압축합니다.
그런 다음 다음 명령을 사용하여 repack PDB 파일의 이름을 _ repack 접미사로 바꿉니다. 다음으로, 설계 모드에서 pepspec을 실행하여 이 명령을 사용하여 시퀀스 다양화를 수행합니다. 그런 다음 gen pepspec pwm을 사용하여 pwm을 생성합니다.
Rosetta 제품군에 포함된 py 스크립트입니다. 이 스크립트를 실행하려면 다음 명령을 사용합니다. 염기서열 로고를 만들려면 이전 단계에서 생성된 펩타이드 염기서열이 있는 파일을 선호하는 텍스트 편집기로 열고 모든 염기서열을 복사합니다.
WebLogo 서버로 이동하여 Multiple Sequence Alignment 텍스트 상자에 시퀀스를 붙여넣습니다. 입력 길이에 따라 원하는 로고 형식과 크기를 선택하고 로고 만들기를 클릭합니다. 이 프로토콜을 사용하여 IRF5 결합 표면에서 보존된 p L x IS 모티프에 대한 아미노산 선호도를 예측했습니다.
서열 다양화에 따라 생성된 위치, 중량 매트릭스 및 서열 로고는 432 위치에서 글루타메이트에 대한 선호, 433 및 435 위치에서 류신 및 이소류신에 대한 선호를 보여주었습니다. 일반적으로 Serine이 차지하는 위치 427, 429 및 436은 아스파르트산 및 글루타메이트에 대한 더 높은 선호도를 보여 인산화 및 IRF5 이합체화의 역할을 강조했습니다. 위치 425는 세린에 대한 높은 선호도를 보였으며, 이는 인산화되지 않은 형태의 단백질-단백질 상호 작용에 관여함을 시사합니다.
