Tibet Tıbbı Üniversitesi'nin 14. Beş Yıllık Planının (2022ZYYGH12) Çağrışım İnşaatı Projesi'nden, Tibet Tıbbı Üniversitesi Eğitim Bakanlığı'nın Temel Laboratuvarı'nın 2022 Açık Konularından (ZYYJC-22-04), Ningxia'nın Temel Araştırma ve Geliştirme Programından (2023BEG02012) alınan mali destek için içten takdirlerimizi ifade ederiz, ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin (XKTD2022013) Xinglin Scholar Araştırma Teşvik Projesi.

Bileşik çözelti, protein çözeltisi ve boya, bir PBS çözeltisine dahil edildi. Daha sonra, numuneler, dijital ısıtma çalkalama kuru banyosu kullanılarak kademeli olarak ısıtıldı ve proteinlerin termal stabilitesi, karmaşık sistem içindeki floresan yoğunluğundaki değişimin ölçülmesiyle değerlendirildi. Ayrıntılı adımlar aşağıda özetlenmiştir ve Şekil 1'de protokole genel bir bakış gösterilmektedir.
1. Çözelti hazırlama
<ol><li>616.75 μL DMSO çözeltisine 0.1 mg umbelliferon ekleyerek 1 mM'lik bir umbelliferon çözeltisi hazırlayın (bkz.</li>
	<li>500 μL ddH 2O çözeltisine 0.1 mg CD40 ekleyerek 200 μg / mLCD40protein çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>9 μL fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) 1 μL 5000x turuncu boya ekleyerek 500x turuncu boya çözeltisi hazırlayın (bkz. NOT: Yukarıdaki işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin ve pipet minimum 0,1 μL aralığına sahip olduğundan, sonraki kullanımı kolaylaştırmak için başlangıçta turuncu protein boyasını 10 kat seyreltin.</li>
</ol>2. Boya performans testi
<ol><li>500x turuncu boyayı bir PBS çözeltisine ekleyin ve boya elde etmek için seyreltin: 1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000 PBS oranları. NOT: DMSO'nun nihai konsantrasyonunun %2'yi (h/v) aşmadığından emin olun.</li>
	<li>Floresan mikroplaka okuyucuyu açın ve 10 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>Bilgisayarı ve veri toplama yazılımını sırayla açın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Cihaz'a tıklayın, ilgili floresan mikroplaka modelini seçin ve veri toplama yazılımında Tamam'ı seçin. NOT: Cihaz ile yazılım arasında başarılı bir bağlantı sağlamak için veri toplama yazılımını açmadan önce floresan mikroplakanın ön ısıtmayı bitirmesini ve paneldeki sıcaklığı görüntülemesini bekleyin.</li>
	<li> Edinme Ayarları'na tıklayın ve veri toplama yazılımında Floresans'ı seçin.</li>
	<li>Programı Dalga Boyları arayüzünde düzenleyin: Lm1 = 470 nm, 570 nm ve ardından Tamam'ı seçin. NOT: Turuncu boya, 300 nm'de UV ışığı veya 470 nm'de görünür ışıkla uyarılabilir ve emisyon 570 nm'de ölçülebilir.</li>
	<li>100 μL / oyukta 96 oyuklu plakalara farklı konsantrasyonlarda turuncu boya (1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000) ve PBS ekleyin. NOT: Çözeltiyi PBS'ye eklemeden önce DMSO'da çözün ve boyanın çökelme eğilimi nedeniyle tam çözünmeyi sağlamak için hazırlama işlemi sırasında 2000 x g'da iyice girdaplayın.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin, veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın ve her boya konsantrasyonunun floresansını her seferinde 2 dakika aralıklarla oda sıcaklığında 13 kez ölçün.</li>
	<li>Her belirlemeden sonra Dışa Aktar düğmesine tıklayın, XML XLS TXT'ye Aktar'ı seçin, Tüm Plakalar'ı seçin, ardından Çıktı Biçiminde Plaka'yı seçin ve son olarak daha fazla analiz için verileri "XLS" formatında bir klasöre kaydetmek için Tamam'a tıklayın. NOT: Bu adımlar, sürekli ölçümün oda sıcaklığında turuncu boyanın otofloresansı üzerindeki etkisini belirlemeye ve optimum boyama konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olur.</li>
	<li>Dijital ısıtmalı çalkalama kuru banyosunu açın, ısıtma sıcaklığını 35 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.</li>
	<li>Boyanın optimum seyreltme oranını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın ve 2 dakika boyunca dijital ısıtma çalkalama kuru banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>PBS çözeltisini ve 35 ° C'de ısıtılan boyama çözeltisini, oyuk başına 100 μL'lik bir hacimde 96 oyuklu plakaya ekleyin.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin ve veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Isıtma sıcaklığını 40 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.</li>
	<li>96 oyuklu plakadaki boya solüsyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne geri pipetleyin ve cihazda 2 dakika ısıtın.</li>
	<li>Boya çözeltisinin absorbansını sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C'de test etmek için adım 2.12-2.15 ve adım 2.9'daki işlemleri tekrarlayın. NOT: Bu adımlar, 35 °C ila 95 °C arasında bir gradyanda sürekli ısıtma altında turuncu boyanın otofloresan stabilitesinin belirlenmesine yardımcı olur. Hızlı sıcaklık düşüşlerinden veya deneysel hatalara yol açabilecek yanlış sıvının eklenmesinden kaçınmak için hızlı çalışmak çok önemlidir.</li>
</ol>3. Proteinin erime sıcaklığının (Tm) tespiti
<ol><li>Sırasıyla 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için CD40 proteini ve turuncu boyayı PBS çözeltisi ile birleştirin.</li>
	<li>CD40 protein çözeltisinin sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda absorbansını değerlendirmek için adım 2.2-2.6 ve adım 2.10-2.16'da belirtilen işlemleri tekrarlayın.</li>
	<li>Verileri kaydetmek ve analiz etmek için adım 2.9'u tekrarlayın ve ardından veri analiz yazılımı kullanarak Tm değerini hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sırasıyla 5 μg / mL, 10 μg / mL, 15 μg / mL, 20 μg / mL, 10 μM ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için PBS çözeltisine CD40 proteini, umbelliferon ve portakal boyası ekleyin. NOT: PBS'de boya, CD40 proteini ve umbelliferonun eşit dağılımını sağlamak için çözelti hazırlama sırasında kuvvetli girdaplama gereklidir.</li>
	<li>Sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda CD40-umbelliferone kompleksleri çözeltisinin absorpsiyonunu ölçmek için adım 3.2-3.3'teki işlemleri tekrarlayın. NOT: Bu adımlar, umbelliferona optimal CD40 protein bağlanma konsantrasyonunu belirlemeyi amaçlayan CD40 proteini ve CD40-umbelliferone komplekslerinin Tm değerlerini belirlemek için gerçekleştirilmiştir.</li>
</ol>

Floresan kullanarak bileşik-protein bağlanmasının yüksek hassasiyetli tespiti

<ol>
	<li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+&amp;#34;five+roots&amp;#34.">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &amp;#34;five roots&amp;#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide.">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice.">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li><li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+constituents,+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui.">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+(Oenanthe+Javanica)+on+immune+function+of+immunosuppression+mice.">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li><li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy.">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li><li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity.">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li><li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma.">IFN&#947; and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer.">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471 (2014).</li><li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily.">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li><li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meltdown:+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry.">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li><li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes.">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules.">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821 (2023).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding.">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li><li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical,+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites.">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238 (2023).</li><li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein.">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases.">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672 (2022).</li><li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+(BLI)+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions.">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD.">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208 (2023).</li><li>Gr&#228;dler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding.">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328 (2023).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein.">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Termal kayma tahlili veya termal floresan tahlili olarak da bilinen DSF, yavaş, programlanmış bir sıcaklık artışı sırasında test numunesinin veya boyanın floresan sinyalindeki değişiklikleri izleyerek numunelerdeki proteinlerin termal denatürasyon sürecini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Başlangıçta Pantoliano14 tarafından kurulan DSF, yüksek verimli bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Ana prosedür, bilgisayar kontrollü ısıtılmış bir plaka üzerindeki s?...

Umbelliferous familyasından bir bitki olan Vicatia thibetica H. Boissieu, Tibet tıbbında yaygın olarak kullanılır ve beş temel bileşenin (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. ve Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Esas olarak kuzeybatı Yunnan, batı Sichuan, Tibet ve diğer bölgeler gibi güneybatı Çin'de dağıtılan kurutulmuş kökü, Angelica1'in yerel bir ikamesi olarak hizmet eder. Kokusuyla bilinen kök, genellikle güveç baharatı olarak kullanılır ve Tibet kerevizi olarak adlandırılan yapraklar nefis yemeklere katkıda bulunur. Bu nedenle, Vicatia thibetica sadece eşsiz bir şifalı bitki olarak değil, aynı zamanda Tibet'te bir besin kaynağı olarak da önem taşımaktadır.
Hem yerel hem de uluslararası araştırmalar, Vicatia thibetica'nın adet kanamasını düzenlemek için faydalı olan kan yenileyici ve qi (güç veya enerji) canlandırıcı özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. Çarpıntı ve kan eksikliğinden kaynaklanan düzensiz adet dismenoresi semptomlarını ele almak için kullanılır ve vücut bağışıklığının antioksidan düzenlenmesi gibi farmakolojik etkiler gösterir2. Vicatia thibetica'nın alkol özütü, siklofosfamid tarafından indüklenen bağışıklığı baskılanmış farelerde vücut kütlesini ve organ indeksini geri kazanma yeteneğini göstermiştir. Ek olarak, serumdaki süperoksit dismutaz aktivitesini arttırır ve malondialdehit içeriğini azaltır, bu da antioksidan kapasitede bir iyileşme ve lipid peroksidasyonu üzerinde dengeleyici bir etki olduğunu düşündürür 2,3. Aynı zamanda, sadece vücudun hematopoietik işlevini objektif olarak yansıtmakla kalmayıp aynı zamanda bağışıklık sisteminde çok önemli bir rol oynayan kan hücrelerinin ve hemoglobinin sayısını artırır 2,3.
Asiküler kristaller ve acı bir tat ile karakterize edilen umbelliferon, küçük bir moleküler ağırlığa sahiptir, uçucudur ve buharla damıtılabilir. Kolayca süblimleşir, suda düşük çözünürlüğe ve organik maddede yüksek çözünürlüğe sahiptir. Vicatia thibetica'nın ana kimyasal bileşenlerinden biri olan umbelliferon, hidrokortizonun neden olduğu immünosupresyon fare modellerinde hücresel bağışıklık, humoral bağışıklık ve spesifik olmayan bağışıklık üzerinde immünomodülatör etkiler sergiler 4,5.
Tümör nekroz faktörü reseptör süper ailesinin bir üyesi olan hücre yüzey molekülü CD40, bağışıklık hücrelerinde yaygın olarak eksprese edilir6. CD40L olarak da bilinen homolog ligandı CD154, aktive edilmiş T lenfositleri tarafından eksprese edilen bir tip II transmembran proteinidir. CD40 aktivasyonu, dendritik hücrelerin (DC) ve monositlerin yüzeyindeki ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu yukarı regüle etme kapasitesine sahiptir. Bu işlem, majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin antijen sunum fonksiyonunu teşvik eder ve ayrıca CD8 + T hücreleriniaktive eder 7.
Makrofajlar, tümör mikroçevresinin oluşumunda ve düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar ve CD40 aktivasyonu, tümör mikroçevresinin makrofajlar tarafından yeniden şekillenmesini artırabilir8. CD40 sinyal aktivasyonu, B hücrelerinin proliferasyonunu ve aktivasyonunu önemli ölçüde etkiler. B hücreleri, CD40 tarafından aktive edildiğinde, etkili antijen sunan hücreler olarak işlev görebilir. Antijenleri sunarlar, efektör T hücresi aktivitesi oluştururlar ve böylece anti-tümör etkilerine katkıda bulunurlar9. Ayrıca, tümör hücrelerinde CD40 aktivasyonu apoptozu indükleyebilir ve tümör büyümesini inhibe edebilir10. CD40 esas olarak Lyn, Fyn, Syk ve diğerleri dahil olmak üzere reseptör olmayan tirozin protein kinazların aktivitesini kontrol ederek sinyalleri iletir. Ek olarak, Bcl-xL, Cdk4 ve Cdk6 proteinlerini uyarma, Rel/NF-kB transkripsiyon faktörlerini aktive etme ve CG-2 ve PI3K10'u fosforile etme yeteneğine sahiptir.
Diferansiyel Taramalı Floresan (DSF) yöntemi, tampon bileşimi, sıcaklık ve küçük moleküllü ligandlar gibi çeşitli çevresel koşulların protein yapılarının termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. DSF için yaygın olarak kullanılan boya, turuncu, çevreye duyarlı, hidrofobik bir boyadır. Normal koşullar altında, protein yapısı katlanır ve hidrofobik segmentini dahili olarak gizler. Sıcaklık arttıkça, proteinin hidrofobik bölgesi daha fazla açığa çıkar ve bu da doğal protein yapısının kademeli olarak parçalanmasına neden olur. Boya, açıkta kalan bu protein kısmına seçici olarak bağlanır ve floresansını arttırır. Tm değerleri daha sonra floresan sinyali algılamadaki11 değişikliklerin izlenmesiyle hesaplanır. Bir dereceye kadar, Tm değerlerindeki değişiklikler, mutasyonlar, tamponlardaki değişiklikler veya ligand bağlanması nedeniyle protein stabilitesindeki değişimleri ölçebilir. Ayrıca, protein katlama işlemi12 sırasında yapısal değişiklikleri gösterebilir. Bu yaklaşım, kesin veriler, geniş bir sıcaklık aralığı, yüksek hassasiyet ve minimum protein numune kaybısunar 13.
Bu çalışmada, floresan tayini, floresan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aparatı yerine floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu modifikasyon, floresan kantitatif PCR cihazı olmayan laboratuvarlarda DSF tespitini mümkün kılar, bu da yöntemi daha az karmaşık hale getirir ve cihaz kurulumu için gereken adımları azaltır, böylece deneysel süreci basitleştirir. Ancak, bu yaklaşımın bazı dezavantajları vardır. Karmaşıklık azalırken, prosedür daha hantal hale gelir. Farklı sıcaklıklarda manuel floresan algılaması gereklidir ve sistemden otomatik ve sürekli floresan toplanması sağlanamaz. Bu nedenle, bu çalışma, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimi araştırmak için DSF tekniğini kullandı ve Tibet tıbbının moleküler mekanizmalarına yeni bakış açıları sağladı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD40 protein</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-P75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexStation 3 multifunctional microplate reader</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>FlexStation 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSYPRO orange dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbelliferone</td>
			<td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td>
			<td>B21854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cd40 protein-umbelliferone interaction via differential scanning fluorescence

Farklı moleküller arasındaki etkileşimlerin araştırılması, hastalık patogenezini anlamanın ve ilaç hedeflerinin taranmasının çok önemli bir yönüdür. Tibet tıbbı Vicatia thibetica'da aktif bir bileşen olan umbelliferon, bilinmeyen bir mekanizma ile immünomodülatör bir etki sergiler. CD40 proteini, bağışıklık tepkisinde önemli bir hedeftir. Bu nedenle, bu çalışma, floresan enzim belirteçleri kullanarak CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimleri analiz etmek için diferansiyel taramalı floresan teknolojisi ilkesini kullanmaktadır. Başlangıçta, protein floresan turuncu boyanın stabilitesi deneysel olarak doğrulandı ve 1:500'lük optimal seyreltme oranı belirlendi. Daha sonra, CD40 proteininin sıcaklıkta erime (Tm) değerinin, konsantrasyondaki bir artışla azalma eğiliminde olduğu gözlendi. İlginç bir şekilde, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimin, CD40 proteininin termal stabilitesini arttırdığı bulundu. Bu çalışma, floresan mikroplakalar ve floresan boyalar kullanarak küçük moleküllü bileşiklerin ve proteinlerin bağlanma potansiyelini tespit etmeye yönelik ilk girişimi temsil etmektedir. Teknik, yüksek hassasiyet ve doğruluk, protein stabilitesi, protein yapısı ve protein-ligand etkileşimleri alanlarında umut verici ilerlemeler ile karakterize edilir, böylece daha fazla araştırma ve araştırmayı kolaylaştırır.

Vicatia thibetica H. Boissieu, a plant in the umbelliferous family, is commonly used in Tibetan medicine and represents one of the essential components of the five basic ingredients (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., and Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.)1. Mainly distributed in southwest China, such as northwest Yunnan, western Sichuan, Tibet, and other areas, its dried root serves as a local substitute for Angelica1. The root, known for its fragrance, is often utilized as a stew seasoning, and the leaves, referred to as Tibetan celery, contribute to delectable dishes. Thus, Vicatia thibetica holds significance not only as a unique medicinal plant but also as a food source in Tibet.
Both domestic and international research indicates that Vicatia thibetica possesses blood-replenishing and qi (power or energy)-invigorating properties, beneficial for regulating menstruation. It is employed to address symptoms of irregular menstrual dysmenorrhea caused by palpitation and blood deficiency, exhibiting pharmacological effects such as antioxidant regulation of body immunity2. The alcohol extract of Vicatia thibetica has demonstrated the ability to restore body mass and organ index in immunocompromised mice induced by cyclophosphamide. Additionally, it increases the activity of superoxide dismutase in serum and reduces the content of malondialdehyde, suggesting an improvement in antioxidant capacity and a balancing effect on lipid peroxidation2,3. Simultaneously, it enhances the number of blood cells and hemoglobin, which not only objectively reflects the body&#39;s hematopoietic function but also plays a crucial role in the immune system2,3.
Umbelliferone, characterized by acicular crystals and a bitter taste, possesses a small molecular weight, is volatile, and can be distilled with steam. It sublimates easily, has low solubility in water, and high solubility in organic matter. As one of the main chemical components of Vicatia thibetica, umbelliferone exhibits immunomodulatory effects on cellular immunity, humoral immunity, and non-specific immunity in hydrocortisone-induced immunosuppression mouse models4,5.
The cell surface molecule CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, is widely expressed in immune cells6. Its homologous ligand, CD154, also known as CD40L, is a type II transmembrane protein expressed by activated T lymphocytes. CD40 activation has the capacity to up-regulate the expression of co-stimulatory molecules on the surface of dendritic cells (DC) and monocytes. This process promotes the antigen presentation function of major histocompatibility complex (MHC) molecules and further activates CD8+ T cells7.
Macrophages play a crucial role in the formation and regulation of the tumor microenvironment, and CD40 activation can enhance the remodeling of the tumor microenvironment by macrophages8. CD40 signal activation significantly influences the proliferation and activation of B cells. B cells, when activated by CD40, can function as effective antigen-presenting cells. They present antigens, generate effector T cell activity, and thereby contribute to anti-tumor effects9. Moreover, CD40 activation in tumor cells can induce apoptosis and inhibit tumor growth10. CD40 primarily transduces signals by controlling the activity of non-receptor tyrosine protein kinases, including Lyn, Fyn, Syk, and others. Additionally, it has the ability to stimulate Bcl-xL, Cdk4, and Cdk6 proteins, activate Rel/NF-kB transcription factors, and phosphorylate CG-2 and PI3K10.
The Differential Scanning Fluorescence (DSF) method is widely employed to assess the impact of various environmental conditions, such as buffer composition, temperature, and small molecule ligands, on the thermal stability of protein structures. The commonly utilized dye for DSF is an orange, environmentally sensitive, hydrophobic dye. Under normal conditions, the protein structure is folded, concealing its hydrophobic segment internally. As the temperature increases, the protein&#39;s hydrophobic region becomes more exposed, resulting in a gradual breakdown of the natural protein structure. The dye selectively binds to this exposed protein portion, amplifying its fluorescence. Tm values are then calculated by monitoring changes in the fluorescence signal detection11. To a certain extent, variations in Tm values can gauge shifts in protein stability due to mutations, changes in buffers, or ligand binding. Furthermore, it can indicate structural alterations during the protein folding process12. This approach offers precise data, a broad temperature range, high sensitivity, and minimal protein sample loss13.
In this study, fluorescence determination was conducted using a fluorescent microplate reader instead of a fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) apparatus. This modification enables DSF detection in laboratories lacking a fluorescent quantitative PCR instrument, making the method less complex and reducing the steps required for instrument setup, thereby simplifying the experimental process. However, there are certain drawbacks to this approach. While the complexity is reduced, the procedure becomes more cumbersome. Manual fluorescence detection at different temperatures is necessary, and automatic and continuous collection of fluorescence from the system cannot be achieved. Thus, this study utilized the DSF technique to explore the interaction between CD40 protein and umbelliferone, providing novel insights into the molecular mechanisms of Tibetan medicine.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişilebilirlik ve Verimlilik için PCR Yöntemlerini Kolaylaştırma

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Our protocol provides a significant advantage by allowing use without specialized equipment. Unlike traditional fluorescence quantitative PCR methods, it simplifies the experimental process, requiring fewer steps and reducing overall complexity, making it safer and easier to conduct. This experiment requires the operator to be very familiar with the experimental procedure and the fluorescent microplate reader, and not to waste too much time during the solution heating and the fluorescence detection.We will focus on the molecular mechanism by which umbelliferone binds to CD14 protein to produce immune effects.

Turuncu boya, hem oda sıcaklığında hem de yüksek sıcaklıklarda Ex = 470 nm ve Em = 570 nm'de sürekli olarak kararlı floresan uyarımı sergiledi. 1:500'lük bir optimal seyreltme oranı belirlenmiştir (Şekil 2A,B). CD40 proteininin konsantrasyonu 15 μg/mL'nin altında olduğunda Tm değerinin saptanması zor olmuştur (Şekil 3A,B). Bununla birlikte, 15 μg/mL'lik bir konsantrasyonda, CD40 protein konsantrasyonundak...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining PCR Methods for Enhanced Accessibility and Efficiency at JoVE.com

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Protokolümüz, özel ekipman olmadan kullanıma izin vererek önemli bir avantaj sağlar. Geleneksel floresan kantitatif PCR yöntemlerinden farklı olarak, deneysel süreci basitleştirir, daha az adım gerektirir ve genel karmaşıklığı azaltır, bu da onu daha güvenli ve yürütülmesi daha kolay hale getirir. Bu deney, operatörün deney prosedürüne ve floresan mikroplaka okuyucusuna çok aşina olmasını ve çözelti ısıtması ve floresan tespiti sırasında çok fazla zaman kaybetmemesini gerektirir.Umbelliferonun bağışıklık etkileri üretmek için CD14 proteinine bağlandığı moleküler mekanizmaya odaklanacağız.

detection-cd40-protein-umbelliferone-interaction-via-differential

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

357 Görüntüleme.  University of Tibetan Medicine. Protokolümüz, özel ekipman olmadan kullanıma izin vererek önemli bir avantaj sağlar. Geleneksel floresan kantitatif PCR yöntemlerinden farklı olarak, deneysel süreci basitleştirir, daha az adım gerektirir ve genel karmaşıklığı azaltır, bu da onu daha güvenli ve yürütülmesi daha kolay hale getirir. Bu deney, operatörün deney prosedürüne ve floresan mikroplaka okuyucusuna çok aşina olmasını ve çözelti ısıtması ve floresan tespiti sırasında çok fazla zaman ka...