Esprimiamo il nostro sincero apprezzamento per il sostegno finanziario ricevuto dal Progetto di Costruzione di Connotazione del 14° Piano Quinquennale dell'Università di Medicina Tibetana (2022ZYYGH12), dalle Materie Aperte 2022 del Laboratorio Chiave di Medicina Tibetana e Istruzione di Base del Ministero dell'Istruzione presso l'Università di Medicina Tibetana (ZYYJC-22-04), dal Programma Chiave di Ricerca e Sviluppo di Ningxia (2023BEG02012), e lo Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (XKTD2022013).

La soluzione composta, la soluzione proteica e il colorante sono stati introdotti in una soluzione PBS. Successivamente, i campioni sono stati sottoposti a riscaldamento graduale utilizzando un bagno secco di riscaldamento digitale e la stabilità termica delle proteine è stata valutata misurando la variazione dell'intensità della fluorescenza all'interno del sistema complesso. I passaggi dettagliati sono descritti di seguito e la Figura 1 illustra una panoramica del protocollo.
1. Preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare una soluzione di umbelliferone da 1 mM aggiungendo 0,1 mg di umbelliferone a 616,75 μL di soluzione di DMSO (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare una soluzione proteica CD40 da 200 μg/mL aggiungendo 0,1 mg di CD40 a 500 μL di soluzione di ddH2O (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare una soluzione di colorante arancione 500x aggiungendo 1 μl di colorante arancione 5000x a 9 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere la tabella dei materiali). NOTA: Eseguire le operazioni di cui sopra sul ghiaccio e, poiché la pipetta ha un intervallo minimo di 0,1 μl, diluire inizialmente il colorante proteico arancione di un fattore 10 per facilitare l'uso successivo.</li>
</ol>2. Test delle prestazioni del colorante
<ol><li>Aggiungere il colorante arancione 500x a una soluzione PBS e diluirlo per ottenere il colorante: rapporti PBS di 1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000. NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO non superi il 2% (v/v).</li>
	<li>Accendere il lettore di micropiastre fluorescenti e preriscaldarlo per 10 minuti.</li>
	<li>Aprire il computer e il software di acquisizione dati in sequenza (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Fare clic su Strumento, scegliere il modello di micropiastra a fluorescenza corrispondente e selezionare OK nel software di acquisizione dati. NOTA: Attendere che la micropiastra a fluorescenza finisca di preriscaldarsi e visualizzare la temperatura sul pannello prima di aprire il software di acquisizione dati per garantire una corretta connessione tra lo strumento e il software.</li>
	<li>Fare clic su Impostazioni di acquisizione e selezionare Fluorescenza nel software di acquisizione dati.</li>
	<li>Modificare il programma nell'interfaccia Lunghezze d'onda: Lm1 = 470 nm, 570 nm, quindi selezionare OK. NOTA: Il colorante arancione può essere eccitato con luce UV a 300 nm o luce visibile a 470 nm e l'emissione può essere misurata a 570 nm.</li>
	<li>Aggiungere diverse concentrazioni di colorante arancione (1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000) e PBS a piastre a 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto. NOTA: Sciogliere la soluzione in DMSO prima di aggiungerla al PBS e agitarla a 2000 x g accuratamente durante il processo di preparazione per garantire la completa dissoluzione a causa della tendenza del colorante a precipitare.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento, fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati e misurare la fluorescenza di ciascuna concentrazione di colorante 13 volte a temperatura ambiente, con un intervallo di 2 minuti ogni volta.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Esporta dopo ogni determinazione, selezionare Esporta in XML XLS TXT, scegliere Tutte le lastre, quindi selezionare Piastra in formato di output e infine fare clic su OK per salvare i dati in una cartella in formato "XLS" per ulteriori analisi. NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare l'impatto della misurazione continua sull'autofluorescenza del colorante arancione a temperatura ambiente e a identificare la concentrazione di colorazione ottimale.</li>
	<li>Accendere il bagno a secco con agitazione digitale, impostare la temperatura di riscaldamento a 35 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.</li>
	<li>Preparare il rapporto di diluizione ottimale del colorante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo nel bagno secco di agitazione riscaldante digitale per 2 minuti.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di PBS e la soluzione colorante, riscaldata a 35 °C, alla piastra a 96 pozzetti a un volume di 100 μl per pozzetto.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento e fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati.</li>
	<li>Impostare la temperatura di riscaldamento a 40 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.</li>
	<li>Pipettare nuovamente la soluzione colorante nella piastra a 96 pozzetti nella provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e riscaldarla nello strumento per 2 minuti.</li>
	<li>Ripetere le operazioni dei passaggi 2.12-2.15 e 2.9 per testare l'assorbanza della soluzione colorante rispettivamente a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C. NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare la stabilità dell'autofluorescenza del colorante arancione in riscaldamento continuo in un gradiente da 35 °C a 95 °C. È fondamentale lavorare rapidamente per evitare rapidi cali di temperatura o l'aggiunta di un liquido sbagliato, che potrebbe portare a errori sperimentali.</li>
</ol>3. Rilevamento della temperatura di fusione (Tm) della proteina
<ol><li>Combinare la proteina CD40 e il colorante arancione con la soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL e 1:500.</li>
	<li>Ripetere le operazioni descritte nei passaggi 2.2-2.6 e 2.10-2.16 per valutare l'assorbanza della soluzione proteica CD40 a temperature rispettivamente di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.9 per salvare e analizzare i dati e successivamente calcolare il valore Tm utilizzando il software di analisi dei dati (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Aggiungere la proteina CD40, l'umbelliferone e il colorante arancione alla soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM e 1:500, rispettivamente. NOTA: Un vortice vigoroso durante la preparazione della soluzione è essenziale per garantire una distribuzione uniforme del colorante, della proteina CD40 e dell'umbelliferone nel PBS.</li>
	<li>Ripetere le operazioni dei passaggi 3.2-3.3 per misurare l'assorbanza della soluzione dei complessi CD40-umbelliferone a temperature di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C, rispettivamente. NOTA: Questi passaggi sono stati condotti per determinare i valori di Tm della proteina CD40 e dei complessi CD40-umbelliferone, con l'obiettivo di identificare la concentrazione ottimale di legame della proteina CD40 con umbelliferone.</li>
</ol>

Rilevamento ad alta sensibilità del legame composto-proteina mediante fluorescenza

<ol>
	<li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+&amp;#34;five+roots&amp;#34.">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &amp;#34;five roots&amp;#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136 (2022).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide.">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice.">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li><li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+constituents,+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui.">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li><li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+(Oenanthe+Javanica)+on+immune+function+of+immunosuppression+mice.">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li><li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy.">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li><li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity.">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li><li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma.">IFN&#947; and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer.">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471 (2014).</li><li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily.">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li><li>Niesen, F. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes.">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li><li>Pantoliano, M. 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M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical,+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites.">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238 (2023).</li><li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein.">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases.">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672 (2022).</li><li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+(BLI)+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions.">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD.">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208 (2023).</li><li>Gr&#228;dler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding.">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328 (2023).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein.">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il DSF, noto anche come saggio di spostamento termico o saggio di fluorescenza termica, è una tecnica impiegata per rilevare il processo di denaturazione termica delle proteine nei campioni monitorando le variazioni del segnale di fluorescenza del campione di prova o del colorante durante un lento aumento programmato della temperatura. Inizialmente istituito da Pantoliano14, il DSF funge da metodo ad alto rendimento. La procedura principale prevede l'aumento della temperatura su una piastra risca...

La Vicatia thibetica H. Boissieu, pianta della famiglia delle ombrellifere, è comunemente usata nella medicina tibetana e rappresenta uno dei componenti essenziali dei cinque ingredienti di base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Distribuita principalmente nel sud-ovest della Cina, come lo Yunnan nord-occidentale, il Sichuan occidentale, il Tibet e altre aree, la sua radice essiccata funge da sostituto locale dell'Angelica1. La radice, nota per la sua fragranza, è spesso utilizzata come condimento per lo stufato e le foglie, denominate sedano tibetano, contribuiscono a piatti deliziosi. Pertanto, la Vicatia thibetica ha un significato non solo come pianta medicinale unica, ma anche come fonte di cibo in Tibet.
Sia la ricerca nazionale che quella internazionale indicano che la Vicatia thibetica possiede proprietà ricostituenti del sangue e tonificanti del qi (potere o energia), benefiche per regolare le mestruazioni. Viene impiegato per affrontare i sintomi della dismenorrea mestruale irregolare causata da palpitazioni e carenza di sangue, esibendo effetti farmacologici come la regolazione antiossidante dell'immunità corporea2. L'estratto alcolico di Vicatia thibetica ha dimostrato la capacità di ripristinare la massa corporea e l'indice degli organi nei topi immunocompromessi indotta dalla ciclofosfamide. Inoltre, aumenta l'attività della superossido dismutasi nel siero e riduce il contenuto di malondialdeide, suggerendo un miglioramento della capacità antiossidante e un effetto equilibrante sulla perossidazione lipidica 2,3. Allo stesso tempo, aumenta il numero di cellule del sangue e l'emoglobina, che non solo riflette oggettivamente la funzione ematopoietica del corpo, ma svolge anche un ruolo cruciale nel sistema immunitario 2,3.
L'ombrellifero, caratterizzato da cristalli aciculari e sapore amaro, possiede un piccolo peso molecolare, è volatile e può essere distillato con vapore. Sublima facilmente, ha una bassa solubilità in acqua e un'elevata solubilità in materia organica. Essendo uno dei principali componenti chimici di Vicatia thibetica, umbelliferone mostra effetti immunomodulatori sull'immunità cellulare, sull'immunità umorale e sull'immunità non specifica in modelli murini di immunosoppressione indotta da idrocortisone 4,5.
La molecola di superficie cellulare CD40, un membro della superfamiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale, è ampiamente espressa nelle cellule immunitarie6. Il suo ligando omologo, CD154, noto anche come CD40L, è una proteina transmembrana di tipo II espressa dai linfociti T attivati. L'attivazione del CD40 ha la capacità di sovraregolare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla superficie delle cellule dendritiche (DC) e dei monociti. Questo processo promuove la funzione di presentazione dell'antigene delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e attiva ulteriormente le cellule T CD8+7.
I macrofagi svolgono un ruolo cruciale nella formazione e nella regolazione del microambiente tumorale e l'attivazione di CD40 può migliorare il rimodellamento del microambiente tumorale da parte dei macrofagi8. L'attivazione del segnale CD40 influenza in modo significativo la proliferazione e l'attivazione delle cellule B. Le cellule B, quando attivate dal CD40, possono funzionare come efficaci cellule presentanti l'antigene. Presentano antigeni, generano attività delle cellule T effettrici e quindi contribuiscono agli effetti antitumorali9. Inoltre, l'attivazione del CD40 nelle cellule tumorali può indurre l'apoptosi e inibire la crescita tumorale10. Il CD40 trasduce principalmente i segnali controllando l'attività delle protein chinasi tirosina non recettoriali, tra cui Lyn, Fyn, Syk e altre. Inoltre, ha la capacità di stimolare le proteine Bcl-xL, Cdk4 e Cdk6, attivare i fattori di trascrizione Rel/NF-kB e fosforilare CG-2 e PI3K10.
Il metodo della fluorescenza a scansione differenziale (DSF) è ampiamente impiegato per valutare l'impatto di varie condizioni ambientali, come la composizione del tampone, la temperatura e i ligandi di piccole molecole, sulla stabilità termica delle strutture proteiche. Il colorante comunemente usato per il DSF è un colorante arancione, sensibile all'ambiente e idrofobo. In condizioni normali, la struttura proteica è ripiegata, nascondendo internamente il suo segmento idrofobico. All'aumentare della temperatura, la regione idrofobica della proteina diventa più esposta, provocando una graduale rottura della struttura proteica naturale. Il colorante si lega selettivamente a questa porzione proteica esposta, amplificandone la fluorescenza. I valori di Tm vengono quindi calcolati monitorando le variazioni nel rilevamento del segnale di fluorescenza11. In una certa misura, le variazioni dei valori di Tm possono misurare i cambiamenti nella stabilità delle proteine dovuti a mutazioni, cambiamenti nei tamponi o legame con i ligandi. Inoltre, può indicare alterazioni strutturali durante il processo di ripiegamento delle proteine12. Questo approccio offre dati precisi, un ampio intervallo di temperatura, un'elevata sensibilità e una perdita minima di campioni proteici13.
In questo studio, la determinazione della fluorescenza è stata condotta utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenti invece di un apparecchio di reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR) a fluorescenza. Questa modifica consente la rilevazione del DSF nei laboratori privi di uno strumento di PCR quantitativa fluorescente, rendendo il metodo meno complesso e riducendo i passaggi necessari per la configurazione dello strumento, semplificando così il processo sperimentale. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in questo approccio. Mentre la complessità è ridotta, la procedura diventa più macchinosa. È necessario il rilevamento manuale della fluorescenza a diverse temperature e non è possibile ottenere una raccolta automatica e continua della fluorescenza dal sistema. Pertanto, questo studio ha utilizzato la tecnica DSF per esplorare l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone, fornendo nuove intuizioni sui meccanismi molecolari della medicina tibetana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD40 protein</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-P75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexStation 3 multifunctional microplate reader</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>FlexStation 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td>
			<td>SoftMax Pro 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSYPRO orange dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umbelliferone</td>
			<td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td>
			<td>B21854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cd40 protein-umbelliferone interaction via differential scanning fluorescence

Lo studio delle interazioni tra diverse molecole è un aspetto cruciale per comprendere la patogenesi della malattia e lo screening dei bersagli farmacologici. L'umbelliferone, un ingrediente attivo della medicina tibetana Vicatia thibetica, mostra un effetto immunomodulatore con un meccanismo sconosciuto. La proteina CD40 è un bersaglio chiave nella risposta immunitaria. Pertanto, questo studio utilizza il principio della tecnologia di fluorescenza a scansione differenziale per analizzare le interazioni tra la proteina CD40 e l'umbelliferone utilizzando marcatori enzimatici fluorescenti. Inizialmente, la stabilità del colorante fluorescente arancione proteico è stata verificata sperimentalmente ed è stato determinato il rapporto di diluizione ottimale di 1:500. Successivamente, è stato osservato che il valore di fusione della temperatura (Tm) della proteina CD40 tendeva a diminuire con l'aumentare della concentrazione. È interessante notare che l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone migliora la stabilità termica della proteina CD40. Questo studio rappresenta il primo tentativo di rilevare il potenziale di legame di composti e proteine di piccole molecole utilizzando micropiastre a fluorescenza e coloranti fluorescenti. La tecnica è caratterizzata da un'elevata sensibilità e accuratezza, promettenti progressi nei campi della stabilità delle proteine, della struttura delle proteine e delle interazioni proteina-ligando, facilitando così ulteriori ricerche ed esplorazioni.

Vicatia thibetica H. Boissieu, a plant in the umbelliferous family, is commonly used in Tibetan medicine and represents one of the essential components of the five basic ingredients (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., and Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.)1. Mainly distributed in southwest China, such as northwest Yunnan, western Sichuan, Tibet, and other areas, its dried root serves as a local substitute for Angelica1. The root, known for its fragrance, is often utilized as a stew seasoning, and the leaves, referred to as Tibetan celery, contribute to delectable dishes. Thus, Vicatia thibetica holds significance not only as a unique medicinal plant but also as a food source in Tibet.
Both domestic and international research indicates that Vicatia thibetica possesses blood-replenishing and qi (power or energy)-invigorating properties, beneficial for regulating menstruation. It is employed to address symptoms of irregular menstrual dysmenorrhea caused by palpitation and blood deficiency, exhibiting pharmacological effects such as antioxidant regulation of body immunity2. The alcohol extract of Vicatia thibetica has demonstrated the ability to restore body mass and organ index in immunocompromised mice induced by cyclophosphamide. Additionally, it increases the activity of superoxide dismutase in serum and reduces the content of malondialdehyde, suggesting an improvement in antioxidant capacity and a balancing effect on lipid peroxidation2,3. Simultaneously, it enhances the number of blood cells and hemoglobin, which not only objectively reflects the body&#39;s hematopoietic function but also plays a crucial role in the immune system2,3.
Umbelliferone, characterized by acicular crystals and a bitter taste, possesses a small molecular weight, is volatile, and can be distilled with steam. It sublimates easily, has low solubility in water, and high solubility in organic matter. As one of the main chemical components of Vicatia thibetica, umbelliferone exhibits immunomodulatory effects on cellular immunity, humoral immunity, and non-specific immunity in hydrocortisone-induced immunosuppression mouse models4,5.
The cell surface molecule CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, is widely expressed in immune cells6. Its homologous ligand, CD154, also known as CD40L, is a type II transmembrane protein expressed by activated T lymphocytes. CD40 activation has the capacity to up-regulate the expression of co-stimulatory molecules on the surface of dendritic cells (DC) and monocytes. This process promotes the antigen presentation function of major histocompatibility complex (MHC) molecules and further activates CD8+ T cells7.
Macrophages play a crucial role in the formation and regulation of the tumor microenvironment, and CD40 activation can enhance the remodeling of the tumor microenvironment by macrophages8. CD40 signal activation significantly influences the proliferation and activation of B cells. B cells, when activated by CD40, can function as effective antigen-presenting cells. They present antigens, generate effector T cell activity, and thereby contribute to anti-tumor effects9. Moreover, CD40 activation in tumor cells can induce apoptosis and inhibit tumor growth10. CD40 primarily transduces signals by controlling the activity of non-receptor tyrosine protein kinases, including Lyn, Fyn, Syk, and others. Additionally, it has the ability to stimulate Bcl-xL, Cdk4, and Cdk6 proteins, activate Rel/NF-kB transcription factors, and phosphorylate CG-2 and PI3K10.
The Differential Scanning Fluorescence (DSF) method is widely employed to assess the impact of various environmental conditions, such as buffer composition, temperature, and small molecule ligands, on the thermal stability of protein structures. The commonly utilized dye for DSF is an orange, environmentally sensitive, hydrophobic dye. Under normal conditions, the protein structure is folded, concealing its hydrophobic segment internally. As the temperature increases, the protein&#39;s hydrophobic region becomes more exposed, resulting in a gradual breakdown of the natural protein structure. The dye selectively binds to this exposed protein portion, amplifying its fluorescence. Tm values are then calculated by monitoring changes in the fluorescence signal detection11. To a certain extent, variations in Tm values can gauge shifts in protein stability due to mutations, changes in buffers, or ligand binding. Furthermore, it can indicate structural alterations during the protein folding process12. This approach offers precise data, a broad temperature range, high sensitivity, and minimal protein sample loss13.
In this study, fluorescence determination was conducted using a fluorescent microplate reader instead of a fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) apparatus. This modification enables DSF detection in laboratories lacking a fluorescent quantitative PCR instrument, making the method less complex and reducing the steps required for instrument setup, thereby simplifying the experimental process. However, there are certain drawbacks to this approach. While the complexity is reduced, the procedure becomes more cumbersome. Manual fluorescence detection at different temperatures is necessary, and automatic and continuous collection of fluorescence from the system cannot be achieved. Thus, this study utilized the DSF technique to explore the interaction between CD40 protein and umbelliferone, providing novel insights into the molecular mechanisms of Tibetan medicine.

Autore in primo piano: Semplificazione dei metodi PCR per una maggiore accessibilità ed efficienza

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Our protocol provides a significant advantage by allowing use without specialized equipment. Unlike traditional fluorescence quantitative PCR methods, it simplifies the experimental process, requiring fewer steps and reducing overall complexity, making it safer and easier to conduct. This experiment requires the operator to be very familiar with the experimental procedure and the fluorescent microplate reader, and not to waste too much time during the solution heating and the fluorescence detection.We will focus on the molecular mechanism by which umbelliferone binds to CD14 protein to produce immune effects.

Il colorante arancione ha costantemente mostrato un'eccitazione stabile della fluorescenza a Ex = 470 nm e Em = 570 nm, sia a temperatura ambiente che a temperature elevate. È stato determinato un rapporto di diluizione ottimale di 1:500 (Figura 2A, B). Il rilevamento del valore di Tm si è rivelato difficile quando la concentrazione della proteina CD40 era inferiore a 15 μg/mL (Figura 3A, B). Tuttavia, a una concentrazione d...

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Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Il nostro protocollo offre un vantaggio significativo consentendo l'uso senza attrezzature specializzate. A differenza dei tradizionali metodi di PCR quantitativa a fluorescenza, semplifica il processo sperimentale, richiedendo meno passaggi e riducendo la complessità complessiva, rendendolo più sicuro e facile da condurre. Questo esperimento richiede che l'operatore abbia molta familiarità con la procedura sperimentale e il lettore di micropiastre fluorescenti, e che non sprechi troppo tempo durante il riscaldamento della soluzione e la rivelazione della fluorescenza.Ci concentreremo sul meccanismo molecolare attraverso il quale umbelliferone si lega alla proteina CD14 per produrre effetti immunitari.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

357 Views.  University of Tibetan Medicine. Il nostro protocollo offre un vantaggio significativo consentendo l'uso senza attrezzature specializzate. A differenza dei tradizionali metodi di PCR quantitativa a fluorescenza, semplifica il processo sperimentale, richiedendo meno passaggi e riducendo la complessità complessiva, rendendolo più sicuro e facile da condurre. Questo esperimento richiede che l'operatore abbia molta familiarità con la procedura sperimentale e il lettore di micropiastre fluorescenti, e che non sprechi troppo te...

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The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.