Bu protokolün genel amacı, hücreleri yarı katı bir matris içinde toplamak ve kaplamaktır. Gömülü hücre agregatları daha sonra üç boyutlu in vitro kültürde veya in vivo transplantasyon deneyleri için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı, hücre agregasyonunu sağlamak için basit metodoloji ve ekipman kullanmasıdır.
Ayrıca bir dizi hücre türüne ve sayısına da uygulanabilir. Bu teknik, dalağın yenilenmesi için gerekli olan belirli bir hücre tipini ortaya çıkarmıştır. Dalak dokusu rejenerasyonunun daha fazla düzenleyicisini ortaya çıkarabilir veya daha geniş doku mühendisliği çalışmaları için bir platform görevi görebilir.
Eksi 20 santigrat derecelik bir dondurucuda 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kutusunu önceden soğutarak başlayın. Daha sonra Parafilmi 10 dakika boyunca% 80 etanole batırın, ardından PBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Hücre çözeltisini hazırlamak için, istenen hücre sayısını 14 mililitrelik konik bir tüpe alın.
Hücreleri 200g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, yaklaşık 20 mikrolitre hacim bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peleti daha sonra kalan süpernatan hacimde yeniden süspanse edilebilir.
Önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak 2 mikrolitre buz gibi Matrigel'i aspire edin. Pipet ucunu çıkarmak için hafifçe döndürün ve çıkarın. Önceden sterilize edilmiş bir Parafilm şeridini gerin ve filmi delmemeye dikkat ederek pipet ucunun ucuna yerleştirin.
Ucun sızdırmaz olduğundan emin olmak için Parafilmi yan tarafa sarmaya devam edin. Ardından hücre çözeltisini Matrigel'in üzerine nazikçe yerleştirin. Pipet ucunu buz üzerinde bırakın ve içine 1,2 mililitrelik küme tüpü yerleştirilmiş 14 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın.
Pipet ucu daha sonra iç içe geçmiş tüp konfigürasyonunun içine yerleştirilebilir ve 5 dakika boyunca 400 g ve 4 santigrat derecede santrifüjlenebilir. Tüpü 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tüp, daha fazla ihtiyaç duyulana kadar buz üzerine yerleştirilebilir.
Parafilmi pipet ucundan dikkatlice çıkarın, ardından ince bir tel piston yerleştirin ve Matrigel tıkacını doku kültürü ortamına atın. Toplanan hücreler 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürlenebilir. Elektrikli makas kullanarak kürkü tıraş edin ve cildi %80 etanol ile temizleyin.
Deride omurgaya dik iki santimetrelik bir kesi yapın ve periton duvarını ortaya çıkarın. Daha sonra böbreğin üzerindeki periton duvarında daha küçük ikinci bir kesi yapılır. Baskı uygulayın ve böbreğin dışını boşaltın.
Düzenli olarak steril PBS uygulayarak böbreğin nemli tutulduğundan emin olun. Böbrek kapsülünü bir çift ultra ince forseps ile sıkıştırın ve ikinci bir çift kullanarak zıt yönlerde hafifçe yırtın. Kapsül zarını böbrek parankiminden dikkatlice ayırın.
Böbrek kapsülünü bir çift forseps ile kaldırın ve pipet ucunu yavaşça açıklıktan kaydırın. Pipet ucuna yavaşça bir tel piston yerleştirin ve Matrigel tapasını çıkarın. Böbreği PBS ile nemlendirin ve periton boşluğuna yeniden içselleştirin.
Periton duvarını 5-O-Vicryl dikişlerle kapatın ve bir AutoClip uygulayıcısı ve iki adet 9 milimetrelik yara klipsi kullanarak cilt insizyonunu kapatın. Bu protokoldeki önemli bir adım, yarı katı bir matris içindeki hücreleri toplamaktır. Optimum santrifüj hızları ile bir orta katman konumlandırması elde edilir.
Daha yüksek hızlar hücreleri pipetin en ucuna kadar iterken, yetersiz hızlar matris boyunca hücre hareketini engeller. Katılaşmanın ardından, Matrigel yapısı pipet ucundan çıkarılabilir. İn vitro kültürlenen dalak stromal yapıları, üç boyutlu küresel organoid yapılar oluşturur.
Organoidler, dokunun tüm çapı boyunca bulunan hücrelerle içi boş olmayan bir yapı sergiler. Beyaz kan hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve hemopoietik olmayan stromal ve endotel hücreleri dahil olmak üzere üç geniş hücre popülasyonundan oluşurlar. Yapılar, doku rejenerasyon çalışmaları için böbrek kapsülünün altına da nakledilebilir.
Dört hafta sonra, santral arteriyoller, B hücre folikülleri, fibroblastik retiküler hücreler, kırmızı pulpa miyeloid hücreleri, marjinal zon metalofilik makrofajlar, kırmızı pulpa sinüzoidleri ve foliküler dendritik hücre ağları, T hücre zonu, kırmızı pulpa makrofajları ve marjinal zon retiküler hücreleri dahil olmak üzere organize dalak doku yapısı gözlenebilir. Hücre agregasyonu ve kapsüllemeyi denerken, hızlı çalışmayı ve tüm malzemeleri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Transplantasyonlar için en önemli adım, pipet ucunu böbrekten çekerken Matrigel tıkacının dışarı atılmasıdır.
Kapsül zarının delinmemesine veya böbrek parankiminin yırtılmamasına dikkat edilmelidir. Bu protokol, dalak dokusu rejenerasyonunda iki stromal hücre popülasyonunun gereksinimlerini araştırmak için kullanıldı. Bu temsili deneyde, sadece trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü-beta pozitif MAdCAM negatif hücrelerden tükenmiş agregalar doku büyümesini başlatamadı, bu da bu özel hücre popülasyonunun dalağın yenilenmesi için gerekli olduğunu düşündürdü.
