Bu yöntem, sitoiskeletin kesme kuvvetlerini nasıl gönderdiği ve integrin ligandların ve kemokinlerin lökositlerin akışla bağlı göçlerini nasıl etkilediği gibi bağışıklık hücresi göç alanındaki temel soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, yeni başlayanlar için gerçekleştirmek kolay göç tayini yeni bir tür olmasıdır. Sadece ticari olarak kullanılabilen ekipman ve reaktiflerin yanı sıra özgür yazılım da kullanır.
Bu yöntem marjinal bölge B hücreleri hakkında bilgi sağlasa da, aktif T hücreleri gibi diğer bağışıklık hücrelerine de uygulanabilir. Deneyden bir gün önce, ICAM-1'in bir aliquot'unu eritin ve PBS'de mililitre başına beş mikrogramlık son konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, bir akış slayt istenilen bölmeleri ICAM-1 30 mikrolitre ekleyin.
Kaydırağı nemli bir odaya yerleştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırmak için dört dereceye ayarlayın. Ertesi gün, bir kuyuya 100 mikrolitre PBS ekleyerek ve sonra odanın diğer kuyudan 100 mikrolitre çekerek odayı yıkayın. Daha sonra, bir odaya 100 mikrolitre engelleme tamponekleyin ve 90 dakika boyunca oda sıcaklığında nemli bir odada slayt kuluçka.
Daha sonra, bir kuyuya 100 mikrolitre PBS ekleyerek, diğer kuyudan çekerek ve sonra hazneye 100 mikrolitre geçiş tamponu ekleyerek odayı yıkayın. Slayt artık kullanıma hazır. Deneye kadar oda sıcaklığında nemli bir odada saklayın.
İlk olarak, bir sıvı pompası takın ve akışkan birim takın. Sonra, pompa yazılımı açın. Daha sonra, 5 ila 10 mililitre geçiş tamponu ile bir kez tüp yıkayın.
Bu yaklaşık bir dakika sürer. Daha sonra, her iki rezervuara eşit olarak 11,7 mililitre geçiş tamponu ekleyin ve hava kabarcıklarını çıkarın. Şimdi, boruyu konektör parçasından yaklaşık 10 santimetre uzakta kıskaca alın ve akışkan üniteyi ısıtılmış kuluçka odasına mikroskopa yerleştirin.
Yazılımda, slayt seçimini mikro slayt VI 0.4'e ve tüp seçeneğini beyaza ayarlayın. Ayrıca, santimetre kare başına yaklaşık dört dynes ve 30 dakika görüntüleme süresi için istenilen kesme stresayarlayın. Daha sonra, pompa yazılımına değerleri girerek istenilen akış hızını ve kesme gerilimini ayarlayın.
Daha sonra, mikroskop kuluçka odası, akışkan birimi ve 37 santigrat dereceye kadar geçiş tampon aliquots önceden ısıtın. Isındıktan sonra, akışkan pompayı test edin, geçiş tamponu rezervuarlarda ileri geri akmasını ve sistemde hava kabarcıkları olmamasını sağlar. İlk olarak, lökositleri izole edin ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi marjinal bölge B hücrelerini arındırın.
Daha sonra, bir etanol nemlendi doku ile slayt alt temizleyin. Odanın bir kuyuya hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini ekleyin ve depolanan geçiş tamponunun 30 mikrolitresini diğer kuyudan çekin. Slaydın üzerini kapatın ve hücrelerin takılması için 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, pozitif menisküs kuyudan çıkana kadar slaytın her kuyusuna yavaş yavaş önceden ısıtılmış geçiş tamponu ekleyin. Pipet ucu ile herhangi bir hava kabarcıkları çıkarın. Hücre yapışmasını etkileyen faktörlerle tutarlılığı korumak önemlidir, bu nedenle arabellekleri ve hücreleri 37 derece de tutun ve arabelleği odaya pipetleme sırasında aşırı güç kullanmaktan kaçının.
Kaydırağı mikroskop aşamasına sıkıştırın ve akışkan borunun işaretlenmemiş tarafını konektör parçasından çıkarın. Daha sonra, hava kabarcıkları olmadan pozitif bir menisküs sonunda yükselir kadar göç tampon ile tüp ucunu doldurun. Tüpün ucunu ters çevirin ve akış odasının üst kuyusu içine takın.
Tüpü kenetlenmiş tutarken, tüpün işaretli ucu için prosedürü tekrarlayın. Şimdi, görüntüleme sistemini Live moduna geçin ve slaytın ortasında ki bir görünüm alanı seçin. Burada, hücrelerüzerinde odak ayarlayın, ve sonra hücrelerin siyah anahat geliştirmek ve beyaz bir iç üretmek için biraz de-odak.
Siyah arka plan ve beyaz merkezi otomatik izleme programında kullanmak daha kolay olacaktır. 10x kuru bir hedef kullanarak 30 dakika boyunca her beş saniyede bir görüntü kaydetmek için görüntüleme sırası programı ayarlayın. Sonra, kaydetmeye başlayın.
Kelepçeyi borudan çıkarın ve pompayı açın. Bu, yapışık olmayan hücrelerin yıkanmasını ve yapışık hücrelerin göç etmeye başlamasına neden olur. Görüntüleme programının sonunda filmi etiketleyip kaydedin.
Bir inhibitör veya hücre geçişi değiştirici kullanıyorsanız, slayt veya akışkan biriminde geçiş tampon koymadan önce hücre süspansiyon hücreleri eklenebilir. Otomatik geçiş izleme çözümlemesi başlatmak için ImageJ programını açın. MTrack2_kt Java dosyasını ImageJ Eklentileri klasörüne kopyalayın.
Eklentiler menüsüaltında Derle ve Çalıştır'ı seçin. Ardından, ImageJ'i yeniden başlatın ve eklenti Eklentiler menüsünde görünmelidir. ImageJ'deki hücre geçişi filmindeki görüntü yığınını açın ve videoyu renkli çerçevelerden hücreleri beyaz arka plandaki siyah nesneler olarak gösteren yüksek kontrastlı görüntülere dönüştürmek için burada gösterildiği gibi görüntüleri işleyin.
Ardından, görüntüleri iki kez keskinleştirin, görüntüleri despect olun ve görüntüleri sekiz bit'e dönüştürün. Resim menüsünde, Parlaklığı Ayarla/Kontrast alt menüsüne gidin ve Kontrast kaydırıcısını maksimum kontrasta koyun. Bu, hücrelerin siyah arka plan daki beyaz nesneler olarak görünmesini sağlayacaktır.
Ardından, hücrelerin beyaz arka plandaki siyah nesneler olarak görünmesini sağlamak için Eşleği Ayarla alt menüsüne geri dön. Şimdi, otomatik hücre izleme eklentisi MTrack2 kt çalıştırın. Seçenekler ekranında, parçacık boyutunu en az bir piksele, parçacık boyutunu en fazla 30 piksele ayarlayın.
Marjinal bölge B hücreleri genellikle beş saniye arayla birbirini izleyen karelerde iki pikseli geçmese de hız değerini 10 piksele ayarlayın. Hücre izleri artık ibidi Chemotaxis Aracı'nı kullanarak analize hazır. Bu iki alan, ICAM-1 kaplamalı slaytlarda tohumlanmış marjinal bölge B hücrelerinin geçiş yollarını gösterir.
Hücreler bu makalede açıklanan yöntemler kullanılarak MTrack2 ile otomatik olarak izlenmiştir. Solda, hücreler statik koşullar altında görüntülendi ve sağ daki hücreler santimetre kare başına dört dinamdan oluşan bir kesme akışına maruz kaldılar. Tek tek hücre parçaları ibidi Chemotaxis Aracı içine her filmin parça arsaları oluşturmak için içe aktarılabilir.
Burada, tek tek hücre izleri, çıkış noktasının aşağısına veya akıntıya karşı sona erdiklerinde siyaha kadar sona erdiğini belirtmek için kırmızı renktedir. Burada hem akış hem de akış koşulları için dört ayrı filmden alınan hücre izlerinin analizi gösterilmiştir. Bu ortalama yönlü geçiş indeksi, hücre hızı, yol düzlüğü ve her iki koşul için son düz çizgi mesafeiçerir.
Bu videoyu izledikten sonra, marjinal bölge B hücrelerinin kesme akışına doğru yön geçişini nasıl görüntüleyebilirsiniz ve hücreleri otomatik olarak nasıl izleyeceğinizi iyi bir şekilde anlamanız gerekir. Bu işlem sırasında, TIRF mikroskobu gibi diğer yöntemler sitoiskelet ve integrinler kesme stresine nasıl yanıt verir gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir?
