Bu metodoloji, canlı hayvanlarda kan monositinin kemotaktik aktivitesini ölçmemize ve kötü diyetlerin monosit fonksiyonu ve bunların altında yatan mekanizmalar üzerindeki etkisini incelememize olanak sağlar. Monosit kaynaklı makrofajlar, fare modellerinde kan monosit bölgesinin sağlığının anlık görüntüsünü sağlayan tek hücreli ve omik teknikleri de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanılarak izole edilebilir ve analiz edilebilir. Bugünkü işlem laboratuvarımda yardımcı doçent olan Dr. Young Joo Ahn ve laboratuvarımda doktora sonrası dr. Luxi Wang tarafından yapılacak.
İşleme başlamadan önce, hücre kültürünü dezenfektanla temizleyin ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membran kaynaklı çözeltiyi buz üzerinde tamamen eritin. 26 gauge iğneler ile bireysel steril bir mililitre şırınga donatmak ve buz üzerinde iğneyerleştirin. Çözelti çözüldükten sonra, her bir mililitreşile birlikte veya kemoterapi olmadan desteklenen 500 mikro litre çözeltiyi yüklemeden önce bodrum membranından türetilmiş çözelti şişesinin üst kısmını alkol beziyle silin.
Sonra tek tip bir fiş oluşumunu sağlamak için yüklü şırınga yüklü bodrum membran türetilmiş çözelti herhangi bir hava kabarcıkları çıkarın. Ayak ucutuya yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, mcp-1 olmadan tüm bir bodrum zarı türemiş çözeltihacmini saniyede yaklaşık 100 mikro litre den anestezili farenin sağ kanadına deri altı olarak enjekte edin. Ve hayvanın sol kanadına MCP-1 ile desteklenen 500 mikro litre lik bazal membran dan elde edilmiş çözelti.
Çözeltinin kaçmasını önlemek ve fareyi tam iyileşmeye kadar izleyerek Bir ısınma yastığına yerleştirmeden önce tek, düzgün bir jel fişinin oluşmasını sağlamak için enjeksiyondan 20 ila 30 saniye sonra şırıngayı yerinde tutun. Enjeksiyondan üç gün sonra, dişe enjekte edilen bir hayvandan sırt kıllarını çıkarın ve alt torasik ve üst lomber vertebra çevresindeki deriyi kavramak için çerseps kullanın. Cilde iki milimetre uzunluğunda bir kesi yapın ve servikal vertebradan coddle vertebral kavşağından bir santimetre yukarıya kadar farenin arka hattı boyunca kesin.
Cildi kas tabakasından ayırın ve cildi polistiren köpük platformunda sabitleyin. Sonra, bir diseksiyon mikroskop altında, dikkatle bodrum membran türetilmiş jel fiş içeren fibröz kapsül kavramak ve fibröz kapsül kaldırmak için ince çerkeler kullanın. Sonra fişi temizlemek için ince makas kullanın.
Daha sonra temizlenmiş bazal membrandan elde edilmiş jel fişini uygun şekilde etiketlenmiş ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bodrum membrandan elde edilen jel fişinin ağırlığını hesaplamak için tüpü yeniden tartın. Bodrum membran kaynaklı jel fiş sindirim için, her mikro santrifüj tüp bodrum membran kaynaklı jel fişi kıyma ve fişler eki 800 mikro litre eklemek için temiz ince makas kullanın.
Prizleri bozmak ve mikro santrifüj tüplerini 37 santigrat derecede, dakikada 1400 dönüşte bir termo mikserde iki saat boyunca yerleştirmek ve bodrum membrandan türetilen jel fişleri tamamen eritmek için maksimum hızda 10 saniye boyunca girdap. Kuluçka sonunda, fiş parçalarını iki kez santrifüj le çökün ve pbs'nin 300 mikrolitresinde peletleri yeniden askıya alın. Her hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini yeni mikro santrifüj tüplere aktarın ve yeni tüplerdeki hücreleri 0,5 mikrolitre kalsin ile etiketlayın.
Bir karbondioksit kuluçka 37 derece santigrat bir 10 dakikalık kuluçka sonra, otomatik bir hücre sayacı üzerinde canlı yeşil floresan pozitif ve ölü olmayan floresan hücrelerin sayısını saymak. Tek bir hücreli Batı leke analizi için, 10 santimetre petri kabının dibinde ki rehydrated tek hücreli Batı leke yongasına bir mililitre seyreltilmiş tek hücreli süspansiyon ekleyin. 5-15 dakika sonra, brightfield mikroskobu altında çip inceleyin.
Mikro kuyuların yaklaşık %15-20'si tek bir hücre tarafından işgal edilmeli ve kuyuların %2'sinden azı iki veya daha fazla hücre içermelidir. Çip düzgün bir şekilde yüklenmişse, çanak 45 derece yatırın ve yakalanan hücreleri çıkarmak için talaşı süspansiyon arabelleğiyle üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, çipi dikkatlice ve tek hücreli Batı aletinin elektroforez hücresine yükleyin, jel tarafı yukarı, ve tüm tek hücreli Batı leke yongasını lizis çalışan tampon ile kaplayın.
Hücre lisisini başlatın ve cihazı uygun deney parametrelerine göre çalıştırın. Koşunun sonunda, oda sıcaklığında yıkama başına taze yıkama tamponu ile iki 10 dakikalık yıkar ile çipi durulayın. İkinci yıkamadan sonra, antikor yoklama odasına ilgi birincil antikor çözeltisi 80 mikrolitre ekleyin ve alt yonga jel tarafı aşağı böylece antikor çözeltisi yonga üzerinde wicks.
Oda sıcaklığında iki saat sonra, bir shaker üzerinde yıkama tampon ve bir kez suda üç kez talaşlı talaş lı talaş talaş lı talaş lı üç kez yongayı yıkayın. Çipi ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, kalan yıkama tamponunu çıkarmak için talaşı üç kez yıkama tamponuyla yıkayın ve talaşı bir slayt spinner'ınüzerinde döndürün.
Tek hücreli Batı leke çipi soymak için, raf üzerinde su ile 60 derece santigrat su banyosu bir 15 mililitrelik tüp raf yerleştirin. Bir duman kaputunda, bir kutuya 40 mililitre sıyırma tamponu ve 320 mikrolitre beta morcepta etanol ekleyin. Çipi 10 santimetrelik petri kabına teneke kutunun içine yerleştirin ve kutuyu Parafilm ile kapatın.
Sonra su banyosunda tüp raf içinde kutu yerleştirin. 90 dakika sonra, çipi yeni bir petri kabına dikkatlice aktarın ve sarsıcıda 15 dakika yıkamak için petri kabına 15 mililitre taze yıkama tamponu eklemeden önce talaşı bir kez yıkayın. Bu temsili deneyde, her fişe alınan hücreler enjeksiyondan bir, üç ve beş gün sonra sayıldı.
McP-1 yüklü fişlerdeki hücre sayısındaki araç yüklü fişlerdeki hücre sayısı çıkarılarak, kemoterapi çekicisine yanıt olarak özel olarak işe alınan hücre sayısı hesaplanmıştır. Beş günlük dönemde hızlandırılmış bir MCP-1 spesifik hücre alımı ve birikimi gözlendi ve enjeksiyondan beş gün sonra günde 136,000 hücreye kadar olan enjeksiyondan sonra günde 31.000 hücreye kadar artış kaydedildi. Tek hücreli Batı leke analizi daha sonra ilgi belirli bağışıklık hücresi belirteçleri kendi ifadesine göre, bodrum membran türetilmiş fişler işe farklı hücre tipleri tanımlamak için kullanılmıştır.
Örneğin, MCP-1 yüklü bazal membran kaynaklı jel fişleri içindeki monosityüzdesi ilk gün düşüktü ve makrofaj sayıları çalışma süresi boyunca sürekli artarken, beşinci gün tekrar düşmeden önce üçüncü günde zirve yaptı. MCP-1 yüklü fişler için, izole hücre popülasyonu içindeki monositlerin artı makrofajların yüzdesi üçüncü gün en yüksekti, bu da üç gün sonra MCP-1 bağımlı kemotaksis tarafından işe alınan hücrelerin büyük çoğunluğunun monosit ler ve makrofajlar olduğunu gösteriyor. Monositlerin toplam sayısı artı makrofajlar genellikle üçüncü güne göre beşinci günde daha yüksek olsa da, üçüncü gün hücre sayısı monosit kemotaksis ve işe alımperferansını daha doğru yansıtmaktadır ve bu nedenle üçüncü gün bodrum membran doğrudan fiş analizleri için tavsiye edilir.
Downstream analizi için tek hücrelerin başarılı edinimi enjeksiyondoğruluğu ve fişler tam kaldırılması bağlıdır. Akım sitometrisi, tek hücreli Batı blotlama, toplu veya tek hücreli RNA dizilimi ve diğer omics prosedürleri işe alınan monosit ve monosit kaynaklı makrofajların karakteristik ve fenotiplerini değerlendirmek için kullanılabilir.
