Kurumumuzun adı olan Maternal-Fetal Tıp Enstitüsü'nden de anlaşılacağı gibi, araştırmalarımız ağırlıklı olarak kadın üreme biyolojisine odaklanmaktadır. Üreme bozukluklarının mekanizmasını anlamayı ve bunları tedavi etmek için potansiyel hedefleri belirlemeyi amaçlıyoruz. Bu yaklaşımın en önemli avantajlarından biri, ticari olarak mevcut ko-kültür sistemlerine kıyasla zaman ve harcamada önemli bir azalma sağlamasıdır.
Ev yapımı iskele, kolayca bulunabilen malzemelerden yapılmıştır ve kurulum maliyetini önemli ölçüde düşürür. Bu çok hücreli in vitro modeller, implantasyon bölgesinin karmaşık bir in vivo anatomisini daha iyi temsil eder. Gelecekte, laboratuvarımız bu karışık tohumlama çok hücreli in vitro modele diğer hücre tiplerini tanıtacak ve endometriyal yaralanma ve intrauterin yapışma gibi hastalıkların patogenezinde hem implantasyon çalışmalarını hem de uterus fonksiyonunu daha fazla araştıracaktır.
Başlamak için, model yapımı için 3D baskılı iskeleyi edinin. Hücre kültürü için, 12 oyuklu bir plakanın altına temiz ve steril 18 milimetre kare bir lamel yerleştirin. Lameli mililitre başına 200 ila 300 mikrogram konsantrasyonda 200 mikrolitre hücre dışı matris ile kaplayın.
Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Ardından hücre dışı matrisi plakadan çıkarın. Daha sonra, uygun birleşmeyi doğrulamak için önceden kültürlenmiş insan embriyonik kök hücrelerini ve Ishikawa hücrelerini mikroskop altında inceleyin.
Daha sonra harcanan ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri iki kez üç mililitre PBS ile yıkayın. Şimdi hücreleri ayırmak için iki mililitre ayrışma enzimi ile 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Tam bir kültür ortamı kullanarak reaksiyonu nötralize edin.
Ardından, yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Şimdi 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile karıştırın ve iki seyreltme faktörünü koruyun. Ardından lamel hemositometre odasının üzerine kaydırın.
Her iki yan bölmeyi de tripan mavisi ile karıştırılmış hücre süspansiyonu ile doldurun. 20X mikroskop altında her iki taraftaki karelerdeki hücre sayısını sayın ve sayımlara göre hücre yoğunluğunu hesaplayın. Şimdi insan embriyonik kök hücrelerini, taze ortam içeren hazırlanmış plakada mililitrede beş hücrenin gücüne 10 ila 10 konsantrasyonda tohumlayın ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ishikawa hücre hattı için, ertesi gün hücreleri lamel olmadan kuyuya tohumlayın. İskeleleri iki gün boyunca etil alkol ve çift damıtılmış su ile iyice ıslatın. Suya batırdıktan sonra, çift damıtılmış suyu çıkarın ve metal kutuyu kapatın.
Daha sonra iskeleleri 121 santigrat derecede bir otoklav kullanarak sterilize edin. Bundan sonra kurumasına izin verin. Ishikawa hücreleri ile kuyuya yaklaşık iki mililitre tamamlayıcı ortam ekleyin.
Bağlı insan embriyonik kök hücrelerinin bulunduğu lamel iskeleye aktarın ve hücre tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. İskeleyi Ishikawa hücreleri içeren kuyuya takın. İkinci kurulum için, Ishikawa hücreli lamel iskeleye yerleştirin ve embriyonik kök hücreleri içeren kuyuya takın.
Ko-kültür sistemlerini 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Kültür ortamını kuyucuklardan dikkatlice çıkarın ve hücreleri steril PBS ile nazikçe durulayın. İnce forseps veya cımbız kullanarak, ekli hücrelere sahip lamelleri kültür kaplarından çıkarın.
İsteğe bağlı olarak, transfer işlemi sırasında nemli kalmalarını sağlamak için lamelleri PBS ile yeni bir kaba koyun. Temiz bir mikroskop lamına bir damla PBS ekleyin ve hücreleri içeren lamel yavaşça damlanın üzerine aktarın ve hücrelerin lam üzerine bakacak şekilde olduğundan emin olun. Hazırlanan slaydı ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına yerleştirin.
Uygun objektif lensi seçin ve odağı ayarlamak için kaba ve ince odak düğmelerini kullanın. Aydınlatma yoğunluğu ve kamera ayarları dahil olmak üzere mikroskop parametrelerini ayarlayın. İstenilen büyütme ve görüş alanlarında görüntü yakalamak için mikroskop yazılımını kullanın.
Her iki hücre tipinin yoğunluğu 72 saat sonra ko-kültür koşulunda düşük kalırken, bağımsız olarak kültürlenen hücre yoğunlukları önemli ölçüde artmıştır. Birlikte kültürlenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin uzunluğu, bağımsız olarak kültürlenenlerden daha kısaydı.
