Araştırmamızın kapsamı, doğal reaktif bileşiklerin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu nedenle, in vitro bir yöntem kullanarak, dokunun homeostazını eski haline getirmek için elastinin bozunmasında ve elastikiyet kaybında rol oynayan bir enzim olan elastazın aktivitesini değerlendirmeyi amaçlıyoruz. Doğal bitki özlerinin miktarının belirlenmesi, aktivite, esas olarak karmaşık kimyasal bileşimleri ve yaygın ölçümlere müdahale edebilecek genellikle güçlü renklenmeleri ile ilgili çeşitli zorluklar sunar.
Güvenilir uyarlanabilir protokoller geliştirmek, bu araştırma alanını ilerletmek için hayati önem taşır. Çalışmamız, basitlik, hassasiyet, hızlı gerilim sonucu ve farklı araştırma ihtiyaçlarına uyarlanabilirlik dahil olmak üzere alanlara çeşitli faydalar sunmaktadır. Başlamak için, analitik bir terazi kullanarak uygun miktarda Tris bazını tartın ve tartılan Tris tabanını bir behere aktarın.
Dereceli bir silindir kullanarak, behere deiyonize su ekleyin. Tris tabanı tamamen eriyene kadar çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın. Ardından dört normal hidroklorik asit kullanarak çözeltinin pH'ını sekize ayarlayın.
İstenilen pH'a ulaşıldığında, çözeltiyi hacimsel bir şişeye aktarın. Deiyonize su kullanarak, şişeyi işaretli hacme kadar doldurun. Hazırlanan tamponu etiketli bir saklama şişesine aktarın ve oda sıcaklığında saklayın.
Numune hazırlama için, bir analitik terazi kullanarak gereken numune miktarını doğru şekilde tartın. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için numuneyi hazırlanan reaksiyon tamponunda çözün. Numuneyi tamamen çözmek için bir vorteks karıştırıcı kullanın.
Ve hazırlanan numuneyi buz üzerinde saklayın. Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar reaksiyon tamponunda çalışan bir elastaz enzimi çözeltisi hazırlayın. Elastaz solüsyonunu kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
Şimdi reaksiyon tamponunda 0.8 milimolar bir SANA çözeltisi hazırlayın. Solüsyonu ışıktan koruyun ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Fenilmetansülfonil florür veya PMSF stoğu için izopropanol içinde 100 milimolar PMSF çözeltisi hazırlayın.
Hazırlanan çözeltiyi buz üzerinde saklayın. Mikrosantrifüj tüpleri kullanarak tüm reaksiyonları üç kopya halinde hazırlayın. Tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Ardından, renk kontrolleri dışında her tüpe 100 mikrolitre SANA substrat solüsyonu ekleyin. Numuneleri karıştırmak için tüpleri birkaç kez nazikçe ters çevirin ve her tüpten 300 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya aktarın, böylece her numune için üçlü ölçümler sağlayın. Son olarak, 96 oyuklu plakayı 410 nanometreye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve absorbansı periyodik olarak, her dakika 20 dakika boyunca veya sinyal oda sıcaklığında stabilize olana kadar ölçün.
Ekstrakt, mililitre başına bir, 0.75 ve 0.5 miligram konsantrasyonlarda zayıf fakat önemli elastaz inhibitör aktivitesi gösterdi ve mililitre başına 0.25 miligramda önemli bir etki göstermedi. Test edilen tüm konsantrasyonlarda yüksek elastaz inhibitör aktivitesi gösteren iki ekstrakt, mililitre başına bir, 0.75 ve 0.5 miligramda pozitif kontrole benzer inhibisyon seviyeleri ile.
