El alcance de nuestra investigación se centra en el desarrollo de compuestos reactivos naturales. Por lo tanto, utilizando un método in vitro, nuestro objetivo es evaluar la actividad de la elastasa, una enzima involucrada en la degradación de la elastina y la pérdida de elasticidad, con el fin de restaurar la homeostasis del tejido. La cuantificación de extractos de plantas naturales, la actividad, presenta varios desafíos, principalmente relacionados con su compleja composición química y su coloración a menudo fuerte que puede interferir con las mediciones comunes.
El desarrollo de protocolos adaptativos fiables es vital para avanzar en este campo de investigación. Nuestro estudio ofrece varios beneficios a los campos, incluyendo simplicidad, sensibilidad, resultado rápido de tensión y adaptabilidad a diferentes necesidades de investigación. Para comenzar, pese la cantidad adecuada de base Tris usando una balanza analítica y transfiera la base Tris pesada a un vaso de precipitados.
Con un cilindro graduado, agregue agua desionizada al vaso de precipitados. Revuelva la solución con un agitador magnético hasta que la base Tris se disuelva por completo. Luego ajuste el pH de la solución a ocho usando cuatro ácidos clorhídricos normales.
Una vez alcanzado el pH deseado, transfiera la solución a un matraz aforado. Con agua desionizada, llene el matraz hasta el volumen marcado. Transfiera el tampón preparado a una botella de almacenamiento etiquetada y guárdelo a temperatura ambiente.
Para la preparación de muestras, pese con precisión la cantidad requerida de muestra utilizando una balanza analítica. Disuelva la muestra en el tampón de reacción preparado para lograr la concentración deseada. Utilice un mezclador de vórtice para disolver completamente la muestra.
Y almacene la muestra preparada en hielo. A continuación, prepare una solución de trabajo de enzima elastasa en tampón de reacción hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Guarde la solución de elastasa en hielo hasta que esté lista para usar.
Ahora prepare una solución de SANA de 0,8 milimolares en tampón de reacción. Proteja la solución de la luz y guárdela a cuatro grados centígrados hasta su uso. Para el fluoruro de fenilmetanosulfonilo, o caldo de PMSF, prepare una solución de PMSF de 100 milimolares en isopropanol.
Guarde la solución preparada en hielo. Prepare todas las reacciones por triplicado utilizando tubos de microcentrífuga. Incuba todos los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A continuación, añada 100 microlitros de la solución de sustrato SANA a cada tubo, excepto los controles de color. Invierta suavemente los tubos varias veces para mezclar las muestras y transfiera 300 microlitros de cada tubo a una placa de 96 pocillos, asegurando mediciones triplicadas para cada muestra. Finalmente, coloque la placa de 96 pocillos en un lector de microplacas configurado a 410 nanómetros y mida la absorbancia periódicamente, cada minuto durante 20 minutos, o hasta que la señal se estabilice a temperatura ambiente.
El extracto uno mostró una actividad inhibidora de elastasa débil pero significativa a concentraciones de uno, 0,75 y 0,5 miligramos por mililitro, sin ningún efecto significativo a 0,25 miligramos por mililitro. El extracto dos demostró una alta actividad inhibidora de la elastasa en todas las concentraciones probadas, con niveles de inhibición similares al control positivo a uno, 0,75 y 0,5 miligramos por mililitro.
