FASP protokolü, güçlü bir şekilde denatüre olan tamponlarla uyumluluğu ve seyreltilmiş bir protein örnekleri için kritik olan numuneyi filtreye konsantre etme yeteneği nedeniyle idrar proteomiğinize ilginç bir yaklaşımdır. FASP protokolü, veri bağımsız analiz kütle spektrometresi ile birleştiğinde, dijital rektal muayeneden sonra toplanan idrar olan EPS-idrarda derin proteom kapsamı elde etmemizi sağlar. Şu anda prostat kanserinde biyobelirteç keşif çabasında görmek üzere olduğunuz yöntemi uyguluyoruz.
İşlem Licia Prestagiacomo, Paola Morelli ve Caterina Gabriele tarafından gösterilecektir. Santrifüj EPS-idrar örnekleri, oda sıcaklığında 2,100 RCF'de 10 dakika boyunca toplamadan sonraki iki saat içinde. Ardından, süpernatantları kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Örnekleri buza ya da dört dereceye atın. İşlemi hızlandırmak için, sindirimden önceki gün örnekleri eksi 80'den eksi 20'ye aktarabilirsiniz. Stok çözümleri olarak, pH sekizde 500 milimolar DTT, %10 SDS, bir azı dişi Tris tampona ihtiyacınız olacak.
Her EPS-idrar örneğinin 500 mikrolitreini 67 mikrolitre SDS, 67 mikrolitre DTT ve 33 mikrolitre Tris tamponu ile seyreltin. Hafifçe sallanarak 10 dakika boyunca 95 derece santigrat derece inkübatör yapın. Santrifüj filtre ünitesini 10.000 Dalton moleküler ağırlığı kesilmiş olarak monte edin.
Ardından, filtreye 300 mikrolitre seyreltilmiş EPS-idrar örneği ekleyin. Yaklaşık 20 dakika boyunca 14.000 g'da santrifüj. Filtrasyonun sorunsuz bir şekilde devam edip etmediğini kontrol etmek için prosedürü 15 dakika kadar sonra geçici olarak kesebilirsiniz.
Tüm çözüm filtreden geçene kadar devam edin. Ardından, 15 dakika boyunca 14.000 g'da 200 mikrolitre üre tamponu ve santrifüj ekleyin. Bu adımı ikinci kez yineleyin.
Akış filtreye dokunmak üzereyken, akış içinden geçirerek eppendorf koleksiyonunu boşaltın. Proteinler filtrede güvendedir. Sistein alkilasyonu için, kullanmadan hemen önce bir iodoasetamid çözeltisi hazırlayın.
Eppendorf şişesinde yaklaşık 10 miligram iodoasetamid ağırlığındadır ve ml başına 9,25 miligram konsantrasyonda üre tamponunda veya azı dişleri açısından 50 milimolar olarak çözün. Her filtreye 50 mikrolitre iodoasetamid çözeltisi ekleyin ve 25 dakika boyunca 6.000 g'da santrifüj ekleyin. Daha düşük santrifüj hızı filtrelerin kuru çalışmamasını sağlar.
Protein alkilasyonundan sonra, filtreleri 20 dakika boyunca 14.000 g'da art arda iki adet 200 mikrolitre üre tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Akışa geç. 20 dakika boyunca 14.000 g'da 200 milimolar üç etil amonyum bikarbonat tampon ve santrifüj ekleyin.
Bu adımı yineleyin. Son bikarbonat yıkamayı tamamen tamamladıktan sonra, filtre ünitesini yeni bir toplama tüpüne aktarın. Ardından, 50 milimolar TEAB tamponunun 60 mikrolitresini ekleyin.
Tripsin mikroliteri başına 200 nanogram konsantrasyonda bir mikroliter tripsin çözeltisi ekleyin. Alternatif olarak, bir Eppendorf şişesindeki tüm örnekler için sindirim tamponunu hazırlayabilir ve her filtreye 61 mikrolitre sindirim tamponu dağıtabilirsiniz. Gece kuluçka sırasında numune buharlaşmasını önlemek için bir ThermoMixer kullanıyorsanız, her filtre ünitesini bir alüminyum folyo tabakası ve ardından bir parafilm katmanı ile sarın.
Numuneleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatır. Ertesi sabah, filtreleri çok kısa bir dönüş için bir tezgah üstü santrifüje aktarın. Döndükten sonra Eppendorf kapaklarını açın ve 140 mikrolitre su ekleyin.
Peptitleri toplamak için şişeleri 25 dakika boyunca 14.000 g'da santrifüjleyin. Toplanan hacim yaklaşık 190 mikrolitre olmalıdır. SDS izlerinin sindirimden uzaklaştırılması için, LC-MS-MS'ten önce peptitlerin güçlü katyon değişimi saflaştırılması önerilir.
Eppendorf kapaklarını bir çift cımbız veya makas gibi keskin bir aletle delerek mikrokolyum tutucuları hazırlayın. Tutucu, santrifüjleme sırasında mikrokolumu barındıracaktır. Hazırlamak için sıkıcı olduklarından, tutucular birden fazla kez kullanılabilir.
Bir künt ve bir iğne kullanarak, uygun ekstraksiyon diskinin bir plasını çıkarın. Ekstraksiyon diskleri, sorbent parçacıklar içeren yumuşak polimerik malzemelerdir. Bu durumda, sorbent güçlü katyon değişim özelliklerine sahip parçacıklardan yapılır.
Plaseyi 200 mikroliter pipet ucuna takın. Piston kullanarak fişi ucun sonuna doğru itin. Küçük disk sıkıca itilmelidir, ancak aşırı güçten kaçınılmalıdır.
Ucu tutucuya yerleştirin ve spin mikrokolumunu orijinal kapağın çıkarıldığı iki mililitre Eppendorf şişesi kullanarak monte edin. Bir gösterge 16 iğnesinden gelen fiş, yaklaşık beş mikrogram peptit yükleme kapasitesine sahip olacaktır. Mikrokolumu ardışık iki yıkama ile şartlandırma.
Uygun hız, diski pipet ucuna ne kadar güçlü bir şekilde iteceğinize bağlı olacaktır. Dakikada 20 ila 30 mikrolitre sırasına göre bir akış hızı elde etmeyi hedefleyin. Yıkama sırasında ve numune yükleme sırasında ucun kurumasını sağlamaya çalışın.
Numuneyi yıkama çözeltisinde beş kat seyreltin ve çözeltideki sonuçları daha yavaş hızda yükleyin. Dakikada yaklaşık 15 ila 20 mikrolitrelik bir akış hızı hedefleyin. Gerekirse, akış at.
Artık deterjanları yıkayın. Ardından, diskin peptit elüasyonundan önce kurumasını bekleyin. Mikrokolumu temiz bir 1.5 Eppendorf tüpüne aktarın ve hemen unu ekleyin.
%20 asetonit içeren 500 milimoler amonyum asetat çözeltisinin yedi mikrolitresi olacak. Organik çözücü yüzdesini düşürmek için elüatları 27 mikrolitre %0,1 formik asitle seyreltin ve ardından LC-MS-MS'te elde eden çözeltinin iki mikrolitresini veriye bağımlı modda algılama ile enjekte edin. Bu protokolde kullanılan LC-MS kurulumuyla ilgili ayrıntılar videonun ilerleyen bölümlerinde verilecektir.
Veritabanı araması ve peptit hata tümleştirmesi yaptıktan sonra, genel tepe alanını hesaplayın. Ardından, FASP sindirmesinde peptit konsantrasyonu tahmin etmek için harici bir standart eğri ile karşılaştırın. Peptit miktarını tahmin ettikten sonra, burada açıklandığı gibi iki ardışık StageTip saflaştırması ile iki mikrogram peptide karşılık gelen yeni bir FASP sindirme aliquot'u arındırın.
Bu protokolde kullanılan LC-MS kurulumu, analitik sütuna doğrudan eklemeyi temel almaktadır. Bindirme sütunu olan bir sistem kullanıyorsanız, çevrimdışı C18 temizleme adımından kaçınabilirsiniz. Her kromatografik malzeme için özel iğneler ve pistonlar kullanmayı unutmayın.
Peptitleri C18 Stage Tip'ten 10 mikrolitre elüent ile elde ettikten sonra, eluat'ı vakumlu santrifüjde birkaç dakika boyunca kısmen buharlaştırarak tam buharlaşmayı önlemeye çalışır. Ardından, %0,1 formik asitten oluşan 47 mikrolitre ekleyin ve elde ettiği çözeltiyi LC-MS analizi için bir HPLC şişesine yerleştirin. Burada kullanılan sistem, bindirme sütunu kullanmadan doğrudan sütun örnek yüklemesini temel haline getirdi.
Analitik kolonlar, bir parça poliamid kaplama çıkarıldıktan sonra 75 mikrometre kimlik kılcal damarı çekilerek kendi içinde yapılır. Elde edilen uç seramik bir kesici ile hafifçe şekillendirilebilir. Kılcal damar daha sonra bir paketleme bombasına yerleştirilir ve C18 üç mikrometre sabit faz parçacıklarının ml izopropanol bulamacı başına 50 miligram ile paketlenir.
10 ila 20 bar azot veya helyum arasında bir gaz basıncına ihtiyaç vardır. Dakikada alt mikroliterde çalışan alternatif veya ticari kromatografi sütunları kullanabilirsiniz. Sütunu bir T parçası üzerinde birleştirin.
Diğer iki uç yüksek voltajlı güç kaynağına ve HPLC döngüsüne bağlanır. Sistemi izokratik akışta çalıştırarak optimum püskürtme voltajını değerlendirin. O zaman analizine başla.
Peptitleri iki saatlik kromatografi gradyanı üzerinde görüntülendiği gibi ayırın. Veri toplama, hızlı bir tam MS hizmet taramasından ve ardından değişken genişlikte öncül pencerelerde 26 MS-MS taramasından oluşacaktır. 20 m/z genişliğinden başlayarak, 350 ila 750 Thompson arasında bir m/z aralığını kapsayacak ilk 20 pencere için.
Daha sonra aşağıdaki beş pencere için 50 m/z genişliğe geçmek ve tek bir MS-MS taramasıyla sona ermek, 200 Thompson yalıtım genişliğine sahip olmak. Daha dar genişlikler, peptit öncüllerinin varlığı açısından spektrumun daha kalabalık bir bölgesini oluşturur. DIA analizi için spektral bir kütüphaneye ihtiyacınız olacaktır.
Spektral kitaplık oluşturmak için, aynı kromatografi gradyanını kullanarak DIA alımı için kullandığınız aynı LC-MS-MS sisteminde birkaç veriye bağımlı deneme gerçekleştirebilirsiniz. Örnek fraksiyonasyonu proteom kapsamını artıracaktır. Aşama İpuçları örnek fraksiyonasyonu için kullanılabilir.
Güçlü katyon değişimi ve temel ters faz iki geçerli alternatiftir. Birkaç FASP sindirme havuzunun 10 mikrogramı ile başlayın. %0,2 TFA son konsantrasyon kullanarak numuneyi asitleştirin.
Peptitleri yüksek kapasiteli C18 Sahne Uçlarına yükleyin. Yüksek peptit miktarları durumunda birden fazla disk kullanın. 10 mikrogram malzeme için iki disk önerilir.
Daha önce açıklandığı gibi C18 saflaştırma gerçekleştirin. Eluat koleksiyonu için birkaç şişe hazırlayın. Kesir sayısı kadar.
Bu durumda 10 fraksiyon adım adım elüasyon ile üretilir. Son yıkamadan sonra, ilk eluent'ten 20 mikrolitre ekleyin. %0.2 amonyum hidroksit, 10 milimoler TEAB, %4 asetonitril.
İlk Eppendorf'ta ilk kesir tamamen geçtikten sonra, Sahne Alanı İpucu'nu bir sonraki koleksiyon şişesine taşıyın. 20 mikrolitre adımda, amonyum hidroksit, 10 milimoler TEAB ve daha sonra artan asetonitrile miktarını kullanarak seyreltin. Örneği kesirledikten ve her kesir üzerinde veriye bağımlı denemeler çalıştırdıktan sonra, MS-MS verilerinin veritabanı araması ile spektral kitaplığınızı oluşturun.
Kütüphane daha sonra, en az üç geçişle atanan en az bir benzersiz peptide dayalı protein nicelleştirmesi için DIA veri analizi yapabilen bir yazılıma aktarılacaktır. İdrar proteomunun geniş bir yelpazesini kapsamayı bekleyin. Bu rakam, proteinlerin beş büyüklük sırasına yayılan bolluk aralığında tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini göstermektedir.
Burada sunulan iş akışı, KONSANTRASYON avantajını ve FASP protokolünün çok yönlülüğünü DIA tarama modunun hassasiyetiyle birleştirir. Bu kombinasyon idrar proteomunun zengin bir haritasını sağlar. Analiz kurulumuz bir bindirme sütununun kullanımını içermediği için, FASP özeti hem güçlü katyon değişimi hem de ters faz Aşama İpuçları ile saflaştırılmıştır.
Bir bindirme sütunu doğrudan analitik sütuna bağlandığında, tersine çevrilmiş aşama Aşama İpuçları adımı atlanabilir. Bu iş akışının kullanımı EPS-idrar örneklerini analiz etmek için önerilir, ancak kullanımı genel olarak idrar proteomiklerine kadar genişletilebilir.
