L'ambito della nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di composti reattivi naturali. Quindi, utilizzando un metodo in vitro, ci proponiamo di valutare l'attività dell'elastasi, un enzima coinvolto nella degradazione dell'elastina e nella perdita di elasticità, al fine di ripristinare l'omeostasi del tessuto. La quantificazione degli estratti vegetali naturali, l'attività, presenta diverse sfide, principalmente legate alla loro complessa composizione chimica e alla loro colorazione spesso forte che può interferire con le misurazioni comuni.
Lo sviluppo di protocolli adattivi affidabili è fondamentale per far progredire questo campo di ricerca. Il nostro studio offre diversi vantaggi ai campi, tra cui semplicità, sensibilità, risultato rapido della tensione e adattabilità alle diverse esigenze di ricerca. Per iniziare, pesare la quantità appropriata di base Tris utilizzando una bilancia analitica e trasferire la base Tris pesata in un becher.
Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere acqua deionizzata al becher. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico fino a quando la base Tris non è completamente sciolta. Quindi regolare il pH della soluzione a otto utilizzando quattro acido cloridrico normale.
Una volta raggiunto il pH desiderato, trasferire la soluzione in un matraccio tarato. Utilizzando acqua deionizzata, riempire il pallone fino al volume contrassegnato. Trasferire il tampone preparato in un flacone etichettato e conservarlo a temperatura ambiente.
Per la preparazione del campione, pesare accuratamente la quantità di campione richiesta utilizzando una bilancia analitica. Sciogliere il campione nel tampone di reazione preparato per ottenere la concentrazione desiderata. Utilizzare un miscelatore a vortice per sciogliere completamente il campione.
E conservare il campione preparato sul ghiaccio. Successivamente, preparare una soluzione di lavoro dell'enzima elastasi nel tampone di reazione fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Conservare la soluzione di elastasi in ghiaccio fino al momento dell'uso.
Preparare ora una soluzione di SANA 0,8 millimolare in tampone di reazione. Proteggere la soluzione dalla luce e conservarla a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per il fluoruro di fenilmetansulfonil, o stock PMSF, preparare una soluzione PMSF da 100 millimolari in isopropanolo.
Conservare la soluzione preparata in ghiaccio. Preparare tutte le reazioni in triplicato utilizzando provette da microcentrifuga. Incubare tutte le provette a temperatura ambiente per 20 minuti.
Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato SANA a ciascuna provetta, ad eccezione dei controlli del colore. Capovolgere delicatamente le provette più volte per miscelare i campioni e trasferire 300 microlitri da ciascuna provetta a una piastra a 96 pozzetti, garantendo misurazioni triplicate per ogni campione. Infine, posizionare la piastra a 96 pozzetti in un lettore di micropiastre impostato a 410 nanometri e misurare l'assorbanza periodicamente, ogni minuto per 20 minuti, o fino a quando il segnale non si stabilizza a temperatura ambiente.
L'estratto uno ha mostrato un'attività inibitoria dell'elastasi debole ma significativa a concentrazioni di uno, 0,75 e 0,5 milligrammi per millilitro, senza alcun effetto significativo a 0,25 milligrammi per millilitro. L'estratto due ha dimostrato un'elevata attività inibitoria dell'elastasi a tutte le concentrazioni testate, con livelli di inibizione simili al controllo positivo a uno, 0,75 e 0,5 milligrammi per millilitro.
