Uzun vadeli araştırma odağı, Down sendromundaki nörolojik bozukluklar için potansiyel terapötikler bulmaktır. Ve şu anki odak noktamız, zihinsel engelliliğin önemli bir nedeni olan Down sendromu bozulmuş nörojenezdir. Down sendromu bozulmuş nörogenezinin, sadece Down sendromu nöral progenitör hücrelerinin yaşlanmasına bağlı olduğuna dair yaygın inanışın aksine, bifazik hücre döngüsü defektinden kaynaklandığını bulduk.
Bu yazıda açıklanan insan IPSC tabanlı protokol kullanılarak bifazik hücre döngüsü defektinin tanımlanması, hem erken fazda proliferasyonu azaltan hücre döngüsü durumunu hem de geç fazda hücre döngüsünden çıkmayı başaramadığını göz önünde bulundurarak gelişimsel potansiyel terapötik stratejileri yönlendirecektir. Başlamak için, tam insan iPCS'nin ortamına, DPBS'ye, hücre ayırma çözeltisine ve mililitre başına 25 nanogram temel fibroblast büyüme faktörü ile desteklenmiş besleyici şartlandırılmış ortama 10 mikromolar kaya inhibitörü ekleyin. Tüm reaktifleri 37 santigrat dereceye ısıtın.
Besleyicilerde altı oyuklu bir iPSC plakası alın. Farklılaşmış kolonileri pipetleyin ve taze tam insan iPSC ortamı ekleyin. Plakayı iki saat boyunca karbondioksit inkübatörde 37 santigrat dereceye yerleştirin.
İnkübasyondan sonra, kuyuları bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın. Ardından, her oyuğa bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 12 ila 14 dakika boyunca bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.
Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu ayrılıyorsa, ancak bazıları yapışık kalıyorsa, plakayı yanlardan hafifçe vurun. Hücre ayırma çözeltisini seyreltmek için her bir oyuğa kalsiyum ve magnezyum ile takviye edilmiş üç mililitre DPBS ekleyin.
Beş mililitrelik bir pipetle, kabarcıkları önlerken topakları kırmak için iki ila üç kez nazik pipetleme yapın. Hücreleri 40 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüje geçirin 2. Süspansiyonu oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Ortamı nazikçe aspire etmek için bir vakum aspirasyon sistemi kullanın.
Şimdi, hücreleri 10 mililitre insan iPSC ortamında yeniden askıya alın. Süspansiyon halindeki tüm hücreleri% 0.1 jelatin ile kaplanmış 15 santimetrelik bir tabağa aktarın ve bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. Hücreli ortamı bir santrifüj 2'de toplayın.
Oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika santrifüjleyin ve ardından ortamı vakum aspirasyon sistemi ile nazikçe aspire edin. Hücreleri, mililitre başına 25 nanogram BFGF ve 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre besleyici şartlandırılmış ortamda yeniden süspanse edin. Hücre sayımından sonra, mililitre başına 30.000 ila 50.000 hücrelik bir süspansiyon hazırlayın.
Süspansiyonu bir kuyu plakasına tohumlayın. İki gün sonra, besleyici şartlandırılmış ortamı nöral progenitör hücre veya NPC ortamı ile değiştirin. Medyayı verildiği gibi ikinci ve 18. günlerde değiştirin.
28. günde, plakadaki ortamı 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş NPC ortamı ile değiştirin. Daha sonra plakayı iki saat boyunca bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süpernatanı aspire edin ve kuyuları bir kez kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın.
Her oyuğa bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Daha sonra hücreleri 4x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Ardından, plakanın her bir oyuğuna üç mililitre kalsiyum ve magnezyum takviyeli DPBS pipetleyin.
Beş mililitrelik bir pipetle, süspansiyonu nazikçe pipetleyin ve topakları kırın. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir santrifüj 2 üzerine yerleştirilmiş 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Santrifüj ve daha önce gösterildiği gibi aspire edin, daha sonra peleti, A vitamini ile B 27 ile takviye edilmiş tanımlanmış farklılaşma ortamının bir mililitresinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra, nitelikli matris kaplı 48 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50.000 hücre tohumlayın. 33. günde, kültür kuyucuklarındaki ortamı nöral farklılaşma ortamı ile değiştirin. Down sendromu kültürlerinde izojenik öploid hücrelere kıyasla TUBB3 pozitif nöronlarda önemli bir azalma gözlendi ve 85. günde yaklaşık iki kat azalma görüldü.
Erken nörojenik evrede Down sendromu kültürlerinde izojenik öploid hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha düşük bir KI67 pozitif hücre oranı gözlendi ve yaklaşık dört kat azalma gösterdi. Geç nörojenik evrede, çoğu izojenik öploid hücre minimal KI67 boyaması ile hücre döngüsünden çıkarken, Down sendromu hücrelerinin çoğunluğu KI67 pozitif kaldı ve beş kat artış gösterdi. İkinci bir Sown sendromu çifti ve izojenik euploid insan iPSC'leri, nöral farklılaşmanın sonunda Down sendromu kültürlerinde TUBB3 pozitif nöron seviyelerinin azaldığını ve PAX6 pozitif nöral progenitör hücrelerin yükseldiğini, TUBB3 pozitif nöronlarda iki kat azalma ve PAX6 pozitif hücrelerde iki kattan fazla artış olduğunu doğruladı.
