장기적인 연구 초점은 다운 증후군의 신경 장애에 대한 잠재적인 치료법을 찾는 것입니다. 그리고 현재 우리의 초점은 지적 장애의 주요 원인인 다운 증후군 손상된 신경 발생입니다. 우리는 다운 증후군 손상된 신경 발생이 이위상 세포주기 결함에 의해 발생한다는 것을 발견했는데, 이는 다운 증후군 신경 전구 세포의 노화 때문이라는 일반적인 믿음과 반대입니다.
이 원고에 기술된 인간 IPSC 기반 프로토콜을 사용하여 이위상 세포주기 결함을 확인하면 초기 단계에서 증식이 감소하는 세포주기 상태와 후기 단계에서 세포주기를 종료하지 못하는 것을 모두 고려하여 잠재적인 치료 전략을 개발할 수 있습니다. 먼저 완전한 인간 iPCS의 배지, DPBS, 세포 분리 용액 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 밀리리터당 25나노그램이 보충된 피더 컨디셔닝 배지에 10마이크로몰의 암석 억제제를 추가합니다. 모든 시약을 섭씨 37도로 데우십시오.
피더에 6웰 플레이트의 iPSC를 사용합니다. 분화된 콜로니를 피펫으로 추출하고 새로운 완전 인간 iPSC 배지를 첨가합니다. 접시를 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 2시간 동안 놓습니다.
배양 후 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 웰을 한 번 씻습니다. 그런 다음 각 웰에 1ml의 세포 분리 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 12-14분 동안 놓습니다.
도립 현미경으로 세포를 관찰합니다. 대부분의 셀이 분리되지만 일부가 부착되어 있는 경우 플레이트를 측면에서 부드럽게 두드립니다. 칼슘과 마그네슘이 보충된 DPBS 3ml를 각 웰에 첨가하여 세포 분리 용액을 희석합니다.
5ml 피펫으로 부드러운 피펫팅을 2-3회 수행하여 기포를 피하면서 덩어리를 부수십시오. 세포를 40마이크로미터 여과기를 통해 50ml 원심분리기에 넣습니다 2. 매체를 온화하게 흡인하기 위하여 200 G.Use에 5 분 동안 실내 온도에 현탁액을 온화하게 흡인하는 진공 포부 체계를 원심 분리기.
이제 10ml의 인간 iPSC 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 현탁액의 모든 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 15cm 접시에 옮기고 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다. 세포가 있는 배지를 원심분리기에 모읍니다 2.
200 G.Then에 5 분 동안 실내 온도에 분리기는 진공 포부 체계를 가진 매체를 온화하게 흡인합니다. 1밀리리터의 피더 컨디셔닝 배지에 세포를 재현탁시키고 BFGF 밀리리터당 25나노그램과 10마이크로몰의 암석 억제제를 보충합니다. 세포 계수 후에, 30, 000에서 50, 밀리리터 당 000의 세포의 현탁액을 준비하십시오.
현탁액을 웰 플레이트에 씨를 뿌립니다. 2일 후, 피더 컨디셔닝 배지를 신경전구세포 또는 NPC 배지로 교체합니다. 주어진 대로 2일차와 18일차에 미디어를 변경합니다.
28일째에 플레이트의 배지를 10마이크로몰의 암석 억제제가 보충된 NPC 배지로 교체합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 상층액을 흡인하고 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 웰을 한 번 세척합니다.
각 웰에 1ml의 세포 분리 용액을 추가합니다. 그런 다음 도립 현미경으로 4배 배율로 세포를 관찰합니다. 다음으로, 칼슘과 마그네슘이 보충된 DPBS 3ml를 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣습니다.
5ml 피펫으로 서스펜션을 부드럽게 피펫팅하고 덩어리를 부수십시오. 50ml 원심분리기 위에 놓인 40마이크로미터 여과기를 통해 세포 현탁액을 걸러냅니다 2. 앞서 설명한 바와 같이 원심분리기를 원심분리하고 흡인한 다음 Trypan blue와 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수하는 비타민 A.Count로 B 27이 보충된 정의된 분화 매체 1밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 50, 000개의 세포를 자격을 갖춘 매트릭스 코팅된 48 웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 33일째에 배양정에 있는 배지를 신경 분화 배지로 교체합니다. 동인성 유배체 세포에 비해 다운 증후군 배양에서 TUBB3 양성 뉴런의 현저한 감소가 관찰되었으며, 85일째에 약 2배의 감소가 뚜렷했습니다.
초기 신경인성 단계에서 다운 증후군 배양에서 KI67 양성 세포의 비율이 동인성 유배체 세포에 비해 현저히 낮게 관찰되어 약 4배의 감소를 보였습니다. 후기 신경인성 단계에서 대부분의 동인성 유배체 세포는 KI67 염색이 최소화된 상태로 세포주기를 빠져나간 반면, 다운 증후군 세포의 대다수는 KI67 양성을 유지하여 5배의 증가를 보였습니다. 두 번째 쌍의 Sown 증후군과 동종 유배체 인간 iPSC는 신경 분화가 끝날 때 다운 증후군 배양에서 TUBB3 양성 뉴런 수치가 감소하고 PAX6 양성 신경전구세포가 증가했으며, TUBB3 양성 뉴런은 2배 감소하고 PAX6 양성 세포는 2배 이상 증가한 것으로 확인되었습니다.
