Долгосрочная исследовательская деятельность сосредоточена на поиске потенциальных терапевтических средств для неврологических расстройств при синдроме Дауна. И в настоящее время мы сосредоточены на синдроме Дауна, нарушенном нейрогенезе, который является основной причиной умственной отсталости. Мы обнаружили, что нарушение нейрогенеза при синдроме Дауна вызвано дефектом бифазного клеточного цикла, вопреки распространенному мнению, что это связано только со старением нейронных клеток-предшественников синдрома Дауна.
Идентификация двухфазного дефекта клеточного цикла с использованием протокола на основе IPSC человека, описанного в данной рукописи, будет стимулировать разработку потенциальных терапевтических стратегий с учетом как состояния клеточного цикла, которое характеризуется снижением пролиферации на ранней стадии, так и неспособностью выйти из клеточного цикла на поздней фазе. Для начала добавьте 10 микромоляров ингибитора горных пород в полную среду iPCS человека, DPBS, раствор для отслоения клеток и питательную среду с добавлением 25 нанограммов на миллилитр основного фактора роста фибробластов. Прогрейте все реагенты до 37 градусов по Цельсию.
Возьмите шестилуночный планшет с ИПСК на кормушках. Отпижите дифференцированные колонии и добавьте свежую полную среду для иПСК человека. Поместите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с углекислым газом на два часа.
После инкубации один раз промойте лунки DPBS, не содержащим кальция и магния. Затем добавьте по одному миллилитру раствора для отслоения клеток в каждую лунку. Поместите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с углекислым газом на 12-14 минут.
Наблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом. Если большинство ячеек отделяются, но некоторые остаются прилипшими, осторожно постучите по пластине с боков. Добавьте в каждую лунку по три миллилитра DPBS с добавлением кальция и магния, чтобы разбавить раствор для отслойки клеток.
С помощью пятимиллилитровой пипетки выполните аккуратное пипетирование два-три раза, чтобы разбить комки, избегая при этом образования пузырьков. Пропустите клетки через 40-микрометровое ситечко в 50-миллилитровую центрифугу2. Центрифугируйте суспензию при комнатной температуре в течение пяти минут при температуре 200 G. Используйте систему вакуумной аспирации для мягкой аспирации среды.
Теперь повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды iPSC человека. Перенесите все клетки во взвешенном состоянии на 15-сантиметровую посуду, покрытую 0,1% желатина, и инкубируйте в инкубаторе с углекислым газом. Соберите среды с ячейками в центрифугу 2.
Центрифугируйте при комнатной температуре в течение пяти минут при температуре 200 G. Затем осторожно отсасывайте среду с помощью вакуумной системы аспирации. Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре питательной кондиционированной среды, дополненной 25 нанограммами на миллилитр BFGF, и 10 микромолярами ингибитора горных пород. После подсчета клеток приготовьте суспензию от 30 000 до 50 000 клеток на миллилитр.
Высейте суспензию в лунку тарелки. Через два дня замените питательную среду на нейральную клетку-предшественника или среду NPC. Смените носитель на второй и 18-й дни, как указано.
На 28-й день замените среду в пластине на среду NPC с добавлением 10 микромоляра ингибитора горных пород. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в углекислом инкубаторе в течение двух часов. После инкубации аспирируйте надосадочную жидкость и один раз промойте лунки DPBS, не содержащими кальция и магния.
Добавьте по одному миллилитру раствора для отслоения клеток в каждую лунку. Затем наблюдайте за клетками под инвертированным микроскопом при 4-кратном увеличении. Затем внесите пипеткой по три миллилитра DPBS с добавлением кальция и магния в каждую лунку планшета.
С помощью пятимиллилитровой пипетки аккуратно пипетируйте суспензию и разбейте комки. Процедите клеточную суспензию через 40-микрометровое ситечко, помещенное над центрифугой объемом 50 миллилитров2. Центрифугируйте и аспирируйте, как было показано ранее, затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре определенной дифференцировочной среды с добавлением В27 с витамином А. Подсчитайте живые клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
Затем засейте 50 000 клеток в каждую лунку квалифицированного 48-луночного планшета, покрытого матрицей. На 33-е сутки замените среду в культуральных лунках на среду для нейронной дифференцировки. Значительное снижение TUBB3-положительных нейронов наблюдалось в культурах с синдромом Дауна по сравнению с изогенными эуплоидными клетками, причем примерно двукратное снижение было очевидно на 85-е сутки.
Значительно меньшая доля KI67-положительных клеток наблюдалась в культурах с синдромом Дауна на ранней нейрогенной стадии, по сравнению с изогенными эуплоидными клетками, демонстрируя примерно четырехкратное снижение. На поздней нейрогенной стадии большинство изогенных эуплоидных клеток вышли из клеточного цикла с минимальным окрашиванием KI67, в то время как большинство клеток с синдромом Дауна оставались KI67-положительными, демонстрируя пятикратное увеличение. Вторая пара ИПСК с синдромом Соу и изогенными эуплоидными человеческими ИПСК подтвердила снижение уровня TUBB3-положительных нейронов и повышение PAX6-положительных нейронных клеток-предшественников в культурах с синдромом Дауна в конце нейронной дифференцировки, с двукратным снижением TUBB3-положительных нейронов и более чем двукратным увеличением PAX6-положительных клеток.
