L'obiettivo della ricerca a lungo termine è la ricerca di potenziali terapie per i disturbi neurologici nella sindrome di Down. E il nostro obiettivo attuale è la neurogenesi compromessa della sindrome di Down, una delle principali cause di disabilità intellettiva. Abbiamo scoperto che la neurogenesi compromessa della sindrome di Down è causata da un difetto del ciclo cellulare bifasico, contrariamente alla credenza popolare che sia dovuta solo alla senescenza delle cellule progenitrici neurali della sindrome di Down.
L'identificazione del difetto del ciclo cellulare bifasico utilizzando il protocollo basato su IPSC umano descritto in questo manoscritto guiderà potenziali strategie terapeutiche di sviluppo considerando sia lo stato del ciclo cellulare che è una ridotta proliferazione nella fase iniziale, sia la mancata uscita dal ciclo cellulare nella fase tardiva. Per iniziare, aggiungere 10 micromolari di inibitore della roccia nel terreno umano completo di iPCS, DPBS, soluzione di distacco cellulare e terreno condizionato con alimentatore integrato con 25 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita basico dei fibroblasti. Scaldare tutti i reagenti a 37 gradi Celsius.
Prelevare una piastra a sei pozzetti di iPSC sugli alimentatori. Pipettare le colonie differenziate e aggiungere un terreno iPSC umano fresco e completo. Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per due ore.
Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti una volta con DPBS privo di calcio e magnesio. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto. Metti la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per 12-14 minuti.
Osservare le cellule al microscopio invertito. Se la maggior parte delle celle si sta staccando, ma se alcune rimangono aderenti, picchiettare delicatamente la piastra dai lati. Aggiungere tre millilitri di DPBS integrato con calcio e magnesio in ciascun pozzetto per diluire la soluzione di distacco cellulare.
Con una pipetta da cinque millilitri, eseguire un pipettaggio delicato due o tre volte per rompere i grumi, evitando la formazione di bolle. Passare le celle attraverso un colino da 40 micrometri in una centrifuga da 50 millilitri 2. Centrifugare la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti a 200 G.Utilizzare un sistema di aspirazione a vuoto per aspirare delicatamente il terreno.
Ora, risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno iPSC umano. Trasferire tutte le cellule in sospensione su un piatto di 15 centimetri rivestito con gelatina allo 0,1% e incubare in un incubatore ad anidride carbonica. Raccogliere il terreno con le celle in una centrifuga 2.
Centrifugare a temperatura ambiente per cinque minuti a 200 G.Quindi aspirare delicatamente il fluido con il sistema di aspirazione a vuoto. Risospendere le cellule in un millilitro di terreno condizionato con alimentatore, integrato con 25 nanogrammi per millilitro di BFGF e 10 micromolari di inibitore della roccia. Dopo il conteggio delle cellule, preparare una sospensione da 30.000 a 50.000 cellule per millilitro.
Seminare la sospensione in una piastra a pozzetti. Dopo due giorni, sostituire il terreno condizionato con la cellula progenitrice neurale o terreno NPC. Cambia i media il secondo e il 18° giorno come indicato.
Il giorno 28, sostituire il terreno nella piastra con un terreno NPC integrato con 10 micromolari di inibitore di roccia. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per due ore. Dopo l'incubazione, aspirare il surnatante e lavare i pozzetti una volta con DPBS privo di calcio e magnesio.
Aggiungere un millilitro di soluzione per il distacco cellulare in ciascun pozzetto. Quindi osserva le cellule al microscopio invertito con un ingrandimento 4x. Quindi, pipettare tre millilitri di DPBS integrato con calcio e magnesio in ciascun pozzetto della piastra.
Con una pipetta da cinque millilitri, pipettare delicatamente la sospensione e rompere eventuali grumi. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri posto sopra una centrifuga da 50 millilitri 2. Centrifugare e aspirare come dimostrato in precedenza, quindi risospendere il pellet in un millilitro di terreno di differenziazione definito integrato con B 27 con vitamina A.Contare le cellule vive utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
Quindi seminare 50.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti rivestita con matrice qualificata. Il giorno 33, sostituire il terreno nei pozzetti di coltura con un mezzo di differenziazione neurale. Una riduzione significativa dei neuroni TUBB3-positivi è stata osservata nelle colture con sindrome di Down, rispetto alle cellule euploidi isogeniche, con una diminuzione di circa il doppio evidente al giorno 85.
Una percentuale significativamente inferiore di cellule KI67 positive è stata osservata nelle colture con sindrome di Down durante la fase neurogenica iniziale, rispetto alle cellule euploidi isogeniche, mostrando una riduzione di circa quattro volte. Nella fase neurogenica avanzata, la maggior parte delle cellule euploidi isogeniche è uscita dal ciclo cellulare con una colorazione minima di KI67, mentre la maggior parte delle cellule con sindrome di Down è rimasta positiva per KI67, mostrando un aumento di cinque volte. Una seconda coppia di sindrome di Sown e iPSC umane euploidi isogeniche ha confermato la riduzione dei livelli di neuroni TUBB3-positivi e l'aumento delle cellule progenitrici neurali PAX6-positive nelle colture di sindrome di Down alla fine del differenziamento neurale, con una riduzione doppia dei neuroni TUBB3-positivi e un aumento di oltre il doppio delle cellule PAX6-positive.
