Kronik eklem hastalığında kıkırdak onarımı, hasarlı dokuları verimli bir şekilde yenilemek için gelişmiş hücre bazlı tedaviler gerektirir. Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri kondrosit bazlı sferoidlere ayırmak için adım adım bir yöntem sağlayarak doku mühendisliği ve hücre tedavisi uygulamalarını destekler. Kronik eklem hastalığında kıkırdak onarımı, hasarlı dokuyu yeterince yenilemek için gelişmiş hücre bazlı tedaviler gerektirir.
Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri kondrosit bazlı sferoidlere ayırmak için adım adım bir yöntem sağlayarak doku mühendisliği ve hücre tedavisi uygulamalarını destekler. Başlıca zorluklar, fibröz kıkırdağı önlemek için iPSC'den türetilmiş hücrelerde tip bir kollajen ekspresyonunu en aza indirmek, olgun highline kıkırdak oluşumu için koşullar yaratmak, sferoid stabilitesi için 3D kültür yöntemlerini geliştirmek ve klinik hacimlerde hücresel materyal üretmek için ölçeklenebilir yaklaşımlar geliştirmektir. Protokol, iPSC'leri alternatif bir kondrosit kaynağı olarak kullanarak bir avantaj sağlar ve invaziv prosedürler olmadan ölçeklenebilir üretime izin verir.
3D kültürleme yoluyla kondrosit fenotipinin daha iyi korunmasını sağlar ve doğal kıkırdak gelişimini taklit eder, bu da kıkırdağa özgü belirteçlerin yüksek ekspresyonu ile doğal kondrositlere çok benzeyen hücrelerle sonuçlanır. iPSC'den türetilmiş kondrosit olgunluğunu ve işlevselliğini arttırmak, in vivo olarak uzun vadeli stabiliteyi sağlamak, fibrozlu üç boyutlu kültür materyalleri oluşturmak ve klinik uygulama için ölçeklenebilir hücresel materyal üretimi geliştirmek için etkili yöntemler geliştirin. Başlamak için, makası 30 dakika boyunca inç kare başına 15 pound ile 121 santigrat dereceye ayarlanmış bir otoklavda sterilize edin.
Makas kuruduktan sonra, santrifüj tüplerini yedi ila sekiz milimetre yüksekliğinde halkalar halinde dilimleyin. Şimdi düşük yapışma özelliğine sahip, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını uygun bir kırma aleti kullanarak küçük parçalara ayırın. Bir davlumbaz içinde gece boyunca 10 mililitre kloroformda yaklaşık bir gram plastik parçacığı çözün.
Pipetleme için uygun olduğundan emin olmak için sıvı plastik çözeltinin viskozitesini doğrulayın. Çözelti çok inceyse, bir ila üç gram ek plastik parçacık ekleyin. Çok kalınlaşırsa, yaklaşık beş mililitre kloroform ile seyreltin.
60 milimetrelik bir Petri kabının ortasına otoklav plastik bir halka yerleştirin. Ardından, plastik bir düğme oluşturmak için halkanın içine sıvı plastik uygulayın. Bulaşıkları iki ila üç saat boyunca laminer bir akış başlığında üstü açık olarak kurumaya bırakın.
Kuruduktan sonra, bulaşıkları 20 ila 30 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakın. Başlamak için, plastik düğmeler içeren modifiye edilmiş Petri kaplarını edinin. Kıkırdak alımından iki gün sonra, kıkırdak parçalarını 60 milimetrelik Petri kapları kullanarak Hank'in solüsyonunda yıkayın.
Daha sonra kıkırdağı otoklav makası kullanarak yaklaşık bir ila iki milimetre çapında parçalar halinde kesin. Kıkırdak parçalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bunları bir orbital çalkalayıcı inkübatörde sekiz ila 12 saat boyunca DMEM'de% 0.01 kollajenaz tip iki çözelti içinde sindirin. Sindirimden sonra, kıkırdak parçalarını DMEM ile ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.
Yıkama solüsyonunu attıktan sonra, parçaları bir kondrosit kültür ortamında yeniden süspanse edin ve bunları %0.1 jelatin solüsyonu ile önceden kaplanmış yapışkan bir T25 şişesine tohumlayın ve inkübe edin. Daha sonra, hücre dışı proteinler içeren bir matris ile önceden kaplanmış altı oyuklu plakalarda indüklenmiş pluripotent kök hücreleri yetiştirin. Kondrositik soya doğru farklılaşmayı başlatmak için, ilk iki gün boyunca orta A'da iPSC'leri kültürleyin.
Üçüncü günde, ortam A'yı, diğer tüm bileşenleri değiştirmeden tutarken CHIR-99021 ve rho-kinaz inhibitörünü içermeyen bir çözelti ile değiştirin. 10. günde, kondrosit benzeri hücreleri kondrogenezi kolaylaştırmak için formüle edilmiş orta B'ye aktarın, daha sonra 700 watt'ta yaklaşık 60 ila 90 saniye boyunca bir mikrodalgada% 1.5 argarozu eritin. Sıvılaştırıldıktan sonra, 96 oyuklu bir hücre süspansiyon kültürü plakasının her bir oyuğuna 75 mikrolitre agaroz ekleyin ve oda sıcaklığında sertleşmesine izin verin.
Daha sonra, her bir oyuğa 150 mikrolitre DMEM ekleyin ve plakayı en az 12 saat boyunca bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin. 12. günde, sferoid başlangıcına devam etmek için androjenez ile ilişkili fenotipik değişiklikleri gözlemleyin. % 0.05'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak hücreleri% 80 birleşimde plakadan ayırın.
% 10 FBS ile eşit hacimlerde DMEM ekledikten sonra, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Hücreleri bir mililitre ortam B'de yeniden süspanse edin ve bunları% 0.1 jelatin çözeltisi ile önceden kaplanmış 75 santimetrelik bir hücre kültürü şişesine aktarın. Hücreler tek tabaka olarak% 80 birleşmeye ulaştığında, onları tekrar tripsin ile ayırın ve orta B'de yeniden süspanse edin.Şimdi hücreleri, 150 mikrolitre ortam B ile birlikte, kuyu başına 100.000 hücre yoğunluğunda% 1.5 agaroz ile kaplanmış 96 oyuklu bir plakaya dağıtın.
Daha sonra, kesilmiş bir ucu olan bir mililitrelik pipet ucu kullanarak sferoidleri kuyulardan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sferoidlerin iki ila üç dakika oturmasına izin verin ve süpernatanı çıkarın. Şimdi sferoidleri dört santigrat derecede temperlenmiş taze çözülmüş, seyreltilmemiş bazal membran matris çözeltisine daldırın.
30 dakika sonra, sferoidleri toplamak için tüpü 100 G'de bir dakika santrifüjleyin. Son olarak, sferoidleri hazırlanan mini biyoreaktörlere aktarın ve altı mililitre orta B ekleyin. Mini biyoreaktörü bir karbondioksit inkübatörünün içine yerleştirin. 19 günlük farklılaşmadan sonra, hücrelerin %99'u kondrojenik belirteçler agrekan, kollajen tip bir, kollajen tip iki ve SOX9 eksprese etti.
Yüksek kaliteli kondrosferler, farklılaşmanın 30. gününde gen ekspresyonu analizi ile değerlendirilen kondrositik gen belirteçlerinin en az% 90 ila 95 ekspresyonuna sahip olanlar olarak tanımlandı. Olgun sferoidler, iki ay sonra bir ila iki milimetrelik tipik bir çapa ulaşan tutarlı bir morfogenez sergiledi ve daha büyük sferoidler, boşluklar veya nekrozlu merkezi bölgeleri gösterdi.
