Biz CBS Bilimsel Company Inc (Chuck Scott ve Victor McKnight teşekkür <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> mühendislik yardım ve 3D odası, gaz değişimi ünitesi, ve ekler üretimi için). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe R21DK067084 ve R43CA141782 için SKK) tarafından desteklenmiştir.

1. Kollajen Kaplama ile Hücre Büyüme için Yukarı ve Aşağı Uçlar hazırlayın <ol><li> Deney için gerekli ekler sayısını hesaplayın. Ayrı bir steril Petri kabı (35 x 10 mm) her koyunuz ve radyoterapi (11 Gy) ile sterilize edin. </li><li> 50 mg / ml, uç başına 154 ul (yüzey alanı 1.54 cm 2 yerleştirin): membran kaplama için kollajen çözüm hazırlayın. </li><li> Ekleme membran (pipet yüzeyine izin vermeyin) yüzeyinde ve sonra dikkatlice üzerinde büyük bir damla oluşturmak için kısım geri kalanı ekleyin bir daire içinde kollajen çözüm birkaç damla (damla başına ~ 20 ul) yerleştirin membran yüzey. Kollajen çözüm yarım küre kalır ve membran yüzeyinden tahliye yok emin olun. </li><li> Bir kapak ile Petri kabı kapak ve düz bir yüzey üzerinde, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Kollajen çözüm aspire ve 160 ul PBS ile kaplayarak bir kez membran yıkayın. </li><li> Aspirasyonute PBS ve kapağı değiştirin. Aynı gün kullanıyorsanız, oda sıcaklığında kuru bir yerde Petri kabı yerleştirin. Aksi takdirde, 4 ° C de çanak yerleştirmek ve 7 gün içinde uç kullanın. </li></ol> 2. Üst ekler Kültür Endotel Hücreleri <ol><li> Istenilen kültür ortamında EC süspansiyonu hazırlayın. Hücre canlılığı&gt;% 98 olduğundan emin olun ve hemen kullanın. </li></ol> Not: insan umbilikal ven EC (HUVEC), 4 için uç başına 160 ul x 10 5 hücre kullanılır. <ol start="2"><li> Bölüm 1 hazırlanan kollajen kaplı ekler ile Petri kapları atın; yemekleri ekler çıkarmayın. Kollajen kaplı zar (pipet dokunmatik yüzey izin vermeyin) yüzeyi üzerinde bir daire içinde hücre süspansiyonu (damla başına yaklaşık 20 ul) çeşitli küçük damla koyun ve daha sonra dikkatli bir şekilde oluşturmak için hücre süspansiyonu geri kalanını ekleyin büyük bir damla. Hücre süspansiyonu Hemis kalmasını sağlamak<html> pherical ve membran yüzeyinden tahliye yok. </li><li> Kapakları değiştirin ve dikkatle hücreleri membran eklemek için izin 30 dakika 37 ° C&#39;de (sallayarak olmadan) bir% 5 CO 2 hücre kültürü inkübatör ve inkübe yemekleri yerleştirin. </li><li> Yavaşça eklemek çanak alt kalır ve tamamen orta ile kaplıdır sağlamak her Petri kabı kültür ortamı 5 ml ekleyin. Kapakları değiştirin ve dikkatle inkübatör geri yemekleri koydu. 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür hücreleri. </li><li> AK katmanı içeren eklemek altına alınacaktır yerel mikro, temsil hücreleri ile ikinci (isteğe bağlı) alt uç hazırlamak için aynı yöntemi kullanın. </li></ol> Not: alt uçlar deneyler dahil olması durumunda, üst ve alt uçlar ilk olarak 3B cihazı (Şekil 4B) içine yerleştirmeden önce uçlar birbirine bağlanır. e &quot;&gt; 3. 3D Akış Odası Cihaz monte <ol><li> , Üst ve alt plakalar birlikte vida boru kullanılarak gaz değişimi ünitesine plakaları bağlamak, temiz bir plastik torba içine monte cihazı yerleştirin ve ışınlama ile çanta ve içindekiler (11 Gy) sterilize edin. </li><li> % 70 etanol ile steril doku kültürü kaputu, sprey içine hücre kültürü inkübatör, yerden bir tepsi-raf çıkarın, silin ve daha sonra büyük bir steril peçete ile tepsi kapağı. </li><li> Kaputun içine ışınlanmış plastik torba yerleştirin, steril inkübatör tepsi çanta ve yerden aygıtı kaldırın. Resim boru ile peristaltik pompaya bağlayın. 0.2 ml / dk &#39;lık bir en uygun hızda için program pompası. </li></ol> Not: elektrik soketi ile pompa bağlamak için, kuluçka arka delikten elektrik kablosu a&#39;ya. Delik hava geçirmez olduğundan emin olmak için kabloyu etrafında soyguncu fişi kullanın. <ol start="4"><li&gt; Sıra 5 - Bir steril 15 ml tüp (&quot;giriş&quot; için) olarak arzu edilen kültür ortamı 7 ml. </li></ol> 4. Başbakan 3D Akış Odası Cihazı <ol><li> Boru (boru kısırlık korumak için küçük steril peçeteler kullanın) gelen metal iğne çekerek prizden giriş hortumu çıkarın. Bir &quot;giriş&quot; ve &quot;çıkış&quot; olarak boru bağlantısı olmayan son olarak boru bağlı metal iğne kullanın. Medya ile 15 ml tüp içine metal iğne giriş yerlerde, boş 15 ml tüp içine çıkış yerleştirin. </li><li> Akış 0.2 ml / dk &#39;da saat yönünün tersine ve akış hızı ayarlanır, böylece pompa açın. Bu cihaz (Şekil 2, Durdur # 1) bağlanır önce orta hemen boru sonuna ulaştığında tüp içine 15 ml giriş tüpünden orta çizmek ve pompa durdurmak için negatif basınç sağlar. </li><li> Sökün cihazın üst ve alt plakalar. Medi 1.550 ul - dikkatlice üst plakası ve yeri 1500 kaldırmakalt kuyulara (orta ya da tek başına ya da deneysel kemokinler artı) um. Alt plaka üzerinde 2 mm - iyi yaklaşık 1 ulaşan bir yarımkürede oluşturmak için yeterli orta içerdiğinden emin olun. </li><li> Hava kabarcığı ekler altında sıkışıp emin, Petri kabı steril forseps kullanarak alt plaka kuyu için hazırlanan ekleme aktarın. Plaka kuru kalmasını sağlamak için alt plaka yüzeyinde görünen herhangi bir ortamda aspire. Alt plaka üzerine geri üst plakası yerleştirin ve vidaları kullanarak plakaları yeniden bağlayın. </li><li> Hemen peristaltik pompa açmak ve 3D cihaz akmasına orta sağlar. Cihazın çıkış ucunu yükseltmek ve plaka arasındaki boşluk içinde kabarcık oluşumunu önlemek için bu konumda muhafaza haznesi. </li><li> Orta gaz değişim birimi için bölme odasına bağlayan ve boru dolmasına izin verin. Orta gaz e ulaşmadan önce hemen pompayı durdurxchange ünitesi (Şekil 2; 2. Durdur). Gaz değişimi ünitesine orta yerine 3 ml, pompa açın ve hava kabarcıkları gaz değişimi birimi yoluyla kaçmasına izin. Çıkış borusu (Şekil 2, durdurma # 3) sonuna kadar 3 cm - ortamı 2 ulaştığında, ortam gaz alış-veriş ünitesinin çıkış tüp doldurmak ve pompa durdurmak için izin vermek için, gaz alış-veriş ünitesinin yükseltebilir. </li><li> Küçük steril peçeteler kullanarak prize giriş metal iğne bağlayın. Bu, gaz alış-veriş ünitesinin ulaştığında, ortam gaz alış-veriş ünitesinin doğru ters yönde akar (saat yönünde) ve hava kabarcıkları kaldırılır sağlamak böylece pompa programlayın. Hava kabarcığı sistemde kalır emin olun. </li><li> Orta tersine akar böylece pompa programlayın. Gaz alış-veriş ünitesinin için test hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin. Gaz değişimi ünitesinin kapağını kapatın, kuvöz içine çalışma sistemi arka tepsiyi yerleştirin ve test hücreleri dolaşımdaki izinİstenen süre boyunca 37 ° C &#39;de 3 boyutlu cihazda örn. </li></ol> Not:% 70 etanol ile pompanın elektrik kablosu temizleyin ve kuluçka içine yerleştirin. 5. Test sona ve Testi için Örnekler toplayın <ol><li> Inkübatör ve kaputu yerden çalışma sistemi ile tepsisini çıkarın. Pompayı durdurmak, giriş ve çıkış çıkarın ve boş steril 15 ml tüpler içine biter yerleştirin. </li><li> Uygunsa kullanımı kadar, buz üzerinde yer hücre süspansiyonu, pompa açın ve sistemden hücre süspansiyonu toplamak. </li><li> Vidaları çıkarmadan ve üst plaka kaldırarak odası sökün. Alt plakadan ekler çıkarın ve Petri kapları aktarabilirsiniz. </li></ol> Not: ekler görselleştirmek ve (kristal viyole dH 2 O% 0.05) in situ hücreleri saymak lekeli veya daha fazla için AB toplamak için tripsinize olabilirtest. <ol start="4"><li> Orta ve alt gözleri hücreleri tüpler içine ve 210 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj çıkarın. Süpernatantı, yıkama ve istendiği gibi hücreler tekrar süspansiyon ve spesifik deneysel hedefleri (aşağıda ayrıntılı olarak ele alınmaktadır), hücrelerin işlem. </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics.">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li><li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+stem+cell+homing.">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li><li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-bone-blood+triad:+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization.">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+movement.">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li><li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions.">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li><li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo.">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li><li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress:+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+(review).">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li><li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress.">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li><li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function.">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow.">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34(+)+compartment.">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li><li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation:+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li><li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+source+matters.">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li><li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells,+which+cause+prolonged+ERK1/2+phosphorylation.">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li></ol>

Cascade Doğal Bilimler Inc &quot;akış koşulları ve bunların kullanım yöntemleri altında in vitro hücre göç değerlendirmek için Aygıt&quot; Patent No ABD 7.927.867 B2 için özel haklar sahiptir. SKK 3D akış odasının cihaz teknolojisi bir mucit ve Cascade Doğal Bilimler Inc kurucularından bilimsel ve hissedarı

3D Cihaz kök hücre biyolojisi, vasküler biyoloji, hematoloji, onkoloji, otoimmünite ve inflamasyon dahil olmak üzere çeşitli alanlarda araştırma için yararlı bir teknoloji olabilir. 3D cihaz araştırmacılar kök hücre ekstravazasyon çağlayan her adımı düzenleyen moleküler mekanizmalarının araştırılması hematopoetik, mezenkimal, sinir ve diğer kök hücre çalışmaları için özellikle faydalı olacaktır. Hücre göçü okuyan araştırmacılar da T-ve B-lenfositler, monositler, nötrofiller, eozinofiller, NK hücreleri ve diğer göçmen hücrelerin farklı göç mekanizmaları incelemek için bu cihazı kullanabilirsiniz. Vasküler biyoloji, cihaz hücre toplanması desteklemek ve in vitro kan-beyin bariyerini taklit etmek EC yeteneği yerel mikro etkisini değerlendirmek için faydalı olacaktır. Hastalığının patogenezinde odaklanan araştırmacılar için, aygıt tip I diyabet, mil boyunca pankreas içine, sitotoksik T hücrelerinin göç incelemek için kullanılabilirastım hastaları, nötrofil göçü, monositler ve bozukluklar, çeşitli siteler yara iyileşmesi için bir hücre alımı, yeni damar ile sitotoksik T hücrelerinin etkileşimini inflamasyonun sitelerine lenfositlerin akciğerlere eozinofil vasıfları ve işe tümörlerinde, sitotoksik T hücrelerinin. Yeni 3D Cihaz aynı zamanda öteleme bilim ve klinik öncesi ilaç geliştirme ve tarama için yararlı bir araç olacaktır. Örneğin, aygıt, intravenöz uygulama için terapötik hücre süspansiyonları hazırlanmasında optimize etmek için normal dokulara karşı yaralı doku tedavi edici hücrelerin alım test etmek için, ve özel bir organ veya doku bu endotelyum ve mikro rolünü incelemek için kullanılabilir süreç. Ilaç geliştirme için, aygıt, bu hedef tümör hücrelerinin ilaç adayları test etmek ve ekstravazasyonu kaskad her adımda blok, bir ilaç teslim olarak göç eden hücrelerin test etmek için kullanılabilecektümör sitelere y araç, insan organ-spesifik endotel veya lokal doku özgü mikro fonksiyonu düzenleyen ve homing kaskad farklı adımlar düzenleyen ilaçların kombinasyonları test etmek için ilaçların test etmek için. Son olarak, yüksek verimli bir sisteme dönüştürülen, cihaz hedef moleküllerin hücre trafiğini aracılık bu küçük moleküller, peptitler, antikorlar ve taranması için kullanılabilir. Teknik detaylar ve ipuçları Akışı altında Rolling ve yapışma ekstravazasyon kaskad kritik adımlar ve in vivo hücre göçü verimini önemli katkı sağlamaktadır. Özellikle şu adımları in vitro statik deneyleri katkı yoktur. Ancak, statik göçü deneyleri düşük afinite etkileşimleri (haddeleme) ve sağlam yapışma destek EC yeteneği dahil olmak üzere hücre sağkalım ve işlevi, üzerinde kayma stresin etkilerini test deneylerde negatif kontrol olarak yararlıdır. 3D cihaz deneyler için ortamın seçimi önemlidir. Ortam özellikle uzun inkübasyon süreleri esnasında dolaşan hücrelerin canlılığı etkileyebilir farklı büyüme faktörlerinin içerir. Buna ek olarak, Ca 2 + ve Mg konsantrasyonu 2 +, fizyolojik akış koşulları altında yapışma etkileşimlerini etkileyebilecek olan ticari bir kültür ortamı içinde önemli ölçüde farklılık gösterir. 3D cihaz ile deneyler planlarken dikkate alınması gereken diğer teknik detayları aşağıda açıklanmıştır. AB tek tabaka seçimi AT&#39;nin hücre yüzeyi imza deney tasarımında dikkate alınmalıdır türleri, kaynak ve hücre kültürü koşullarının dokusu da dahil olmak üzere çeşitli parametreler, etkilenir. Bazı sık kullanılan EC akciğer kaynaklı mikrovasküler EC (LDMVEC), kemik EC (BMDEC), beyin kaynaklı EC (BDEC) iliği kaynaklı ve HUVEC içerir.Avrupa Komisyonu özellikleri de kökenlerine göre değişir. Örneğin, çelik ve yapışma sorumludur BMDEC yapısal olarak ifade selektinler ve VCAM-1, BDEC, LDMVEC ve HUVEC Normal koşullar altında, bu moleküllerin ifade böyle değildir. Bu nedenle, BDEC, LDMVEC ve HUVEC ile kaplanmış uçlar TNF α (10 ng / ml, 4 saat) taklit etmek veya inflamasyon ve yerleşme moleküllerinin ekspresyonunu teşvik etmek için diğer faktörler ile tedavi edilebilir. Yerel mikro ile karışma Test Yerel mikro AT fonksiyonlarını düzenler ve hücre ekstravazasyon katılımını anlamada artan bir ilgi vardır. Sonuçlarımız EC tek tabaka altında stromal hücre tek tabaka yerleştirilmesi önemli ölçüde hücreleri dolaşımdaki damar dışına artırdığını göstermektedir. Bu bulgu, EC ve stroma arasında karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneğini artırır göstermektedir. Moreover, farklı mikroçevrelerde (örneğin mezenkimal kök hücreler, akciğer fibroblast, tümör hücreleri, astrositler) hücreleri ekleme belirli vasküler yatak taklit için yardımcı olabilir. Özellikle, beyin türevli AT ve astrositler bir arada, kan-beyin bariyerini taklit etmek için yararlı bir yaklaşım olabilir. Benzer şekilde, hastalar, ya da in vitro olarak manipüle normal hücrelerden elde edilen hücreler, belirli bir hasta mikro taklit yardımcı olabilir. Çalışmalarda, biz% 50 izdiham büyüdü stromal hücreleri ile alt ekler kullanılır. Uçlarda mikroçevredeki hücrelerin optimum yoğunluk çalışmanın hedeflerine bağlı olsa da, bu kolayca manipüle ve kontrol edilebilir. Bir kayma gerilmesi hızı seçerek Bu Von Andrian ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir çünkü 0,8 dyn / cm 2 kayma gerilmesi burada kullanılmıştır. kemik iliği microvasculatur içinde kayma gerilmesi içinhematopoetik progenitör hücrelerin dolaşım çıkmak ve normal fizyolojik koşullar 15 altında dokulara girerler e,. Bunun aksine, kesme stresi yüksek düzeyde hücre ekstravazasyonu sınırlıdır daha büyük kaplar, gözlenir. Bu nedenle, yüksek kesme kuvveti oranları, çeşitli hücre tipleri ekstravazasyonu inceleyen deneyler için ilave kontroller olarak kullanılabilir. Kayma gerilimi altında hücrelerin hayatta kalma hücre tipi ve ex vivo hücre tedavileri (Goncharova ve ark., Yayınlanmamış gözlem) dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır ve bu nedenle dikkatli bir şekilde test sırasında değerlendirilmelidir. Kayma stres düzeyleri farklı (kayma gerilmesi direnç) Hücre hassasiyeti 0,8 dyn / cm 2 ile 6 dyn / cm 2 aşamalı kayma gerilmesi oranı artırmak için peristaltik pompa programlanarak değerlendirilebilir. Bu testler sırasında, hücreler olarak kullanarak hücre ölümü izlemek için gaz değişimi odasından periyodik olarak alınabilirBu tripan mavi dışlama, anneksin V ve PI boyama ve apoptoz işaret ifadesi olarak söylüyor. Deneyler parankimi türetilen ex vivo olarak işlenmiş hücreler veya hücre kayma stres direnci test etmek için tasarlanmıştır, bu, kan yoluyla bulaşan hücreleri gibi ek bir pozitif kontroller, deneyler dahil edilmesi tavsiye edilir. Uç gözenek büyüklüğü ve ECM kaplamanın seçimi Ekler çeşitli gözenek boyut (3, 5, ve 8 mikron) mevcuttur. Gözenek boyutunun seçimi, dolaşımdaki testi hücrelerinin boyutu ve özelliklerine bağlı olacaktır, bu da statik transwell tahliller için de geçerlidir. Bir büyük gözenek boyutu (8 mikron) ile ekler gibi epitel kökenli tümör hücreleri gibi büyük hücrelerin damar dışına test etmek için tavsiye edilir. Lökosit veya hematopoetik kök hücrelerin daha yaygın 5 mikron gözenek ekler ile test edilir, ve 3 mikron gözenek ekler iyi s damar dışına test için ayrılmıştırMaller hücreleri. Ancak, tek başına test hücre boyutu tek önemli faktör değildir ve biz birkaç gözenek boyutları ile ekler test tavsiye ederiz. Bizim ilk çalışmalarda, biz ekler üzerinde AT büyümeyi desteklemek ve&gt; 4 saat kayma gerilmesi dayanma kabiliyetlerini için çeşitli ECM test. ECM Matrigel, poli-D-lizin, fibronektin, laminin, yazın dahil test edilen I kollajen, Hidrojel, Meta-keratin I, II, III, IV, ve Extracel. EM büyümesi için en iyi sonuçlar Extracel, fibronektin ve kollajen ile elde edilmiştir. Ancak, bizim ellerde, 0.8 mg / cm 2 Extracel önemli ölçüde zarından testi hücrelerinin göçü azalır. Bu nedenle şimdi ekler kaplama için fibronektin (5 mg / cm 2) veya kollajen (5 mg / cm 2) kullanın. Bununla birlikte, ECM&#39;nin optimum seçimi muhtemelen AT türüne ve test hücrelerinin transmigratory özellikleri hem de etkilenir. Bir ön deney Integri test etmek için gerekenAB tek tabaka ty seçilen ECM yetişen. Örneğin, kültür ortamı ile doldurulmuş petri levhalar içinde EM mono tabakaları ile yerine önceden kaplanmış uçlar, makaslama kuvveti (düşük ayar) oluşturmak için, bir çalkalayıcı üzerinde yemekleri yerleştirmek, ve 37 ° C&#39;de inkübe edin ve% 5 12 saat boyunca CO2. Kesme stresine maruz kaldıktan sonra EM bütünlüğü kristal mor boyama ile değerlendirilebilir. Optimal test hücre konsantrasyonları seçimi Dolaşım çıkmak için Test hücreleri yeteneği, her bir hücre tipine özgü bir çok özelliklerine bağlıdır. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üretmek için, dolaşan hücre yoğunluğu hücre yeterli sayıda pozitif kontrol kuyularına geçiş sağlamak için optimize edilmelidir. Bu nedenle, sisteme yüklenen hücre sayısı ve arasındaki ilişkiyi anlamak için hücre yoğunlukları bir dizi (örneğin 10 3 / ml 10 7 / ml) ile ilk testleri tavsiyegöçü geçmesi hücre sayısı. Buna ek olarak, en iyi dolaşımdaki konsantrasyonunu farklı kaynaklardan elde edilen aynı hücre tipi için farklı olabilir. Örneğin, CD34 + hücreler hematopoetik kök hücre ve kararlı soy özel ataları hem içeren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Bunlar kemik iliğinden elde edilebilir, periferik kan harekete ve göbek kordon kanı. Bu üç kaynaklardan elde edilen CD34 + hücreleri, farklı hedef arama ve yerleştirilmesiyle özellikler 16-18 sahiptirler, bu nedenle cihazın 3B, bu hücreler test etmek için koşullar tam ölçekli bir çalışma öncesi optimize edilmelidir. Optimum hücre dolaşım süresi seçimi Optimal dolaşım süresi her bir hücre tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Dolaşım için gereken minimum zaman statik göç deneyleri sonuçlarından çıkarım olabilir, ancak bu exten olabilirHücrelerin kesme stresine tabi tutulduğunda ded. 4 ve 96 saatleri arasında dolaşımı kez test pilot çalışmalar önerilir. Gaz alış-veriş ünitesinin Gaz alış-veriş ünitesinin ana amacı, standart bir doku kültürü kuluçka ayarları benzer 3D aygıt içinde dolaşan orta bölgesi CO2 optimum konsantrasyonu elde etmektir. Gaz alış-veriş ünitesinin ayrıca Test hücreleri ve bileşikler ilave edilmesi için ve test sırasında prob ve numune toplamak için kullanılabilir. Test hücre sayıları Değerlendirilmesi Sirkülasyon hücreleri gaz değişimi ünitesi ile deney sırasında farklı zamanlarda tadına bakabilirsiniz. Deneyin sonunda, dolaşımda kalan hücreler çıkışında toplanan edilebilir. 3D cihaz deney sonunda demonte edildiğinde, transmigrated hücreleri alt kuyulardan toplandı ve f toplanabilirya da daha fazla analizi. Giriş hücreleri etiketsiz ise, transmigrated hücreleri tripan mavi ve mikroskobik sayılan canlı / ölü hücreleri ile boyanmış olabilir. Alternatif olarak, giriş hücreleri 3D cihazın içine yerleştirmeden önce canlı hücre görüntüleme için çok &quot;hücre izci&quot; bir boya ile işaretlenmiş olabilir, bu durumda, hücreler hasat floresans ölçümü için lize edilmelidir transmigrated. En uygun örneklem büyüklüğü seçimi Istatistiksel analiz izin vermek için, bir örneklem büyüklüğü iki taraflı t-testi ile 0.05 anlamlılık düzeyinde test iki grup arasında ortalama yüzde değişiklikler varsayımsal farkı tespit etmek için yaklaşık% 80 güç sağlayacak seçilmelidir. Kemik iliği hücreleri ile deneyimlere dayanarak, biz 3 boyutlu cihaz deneyler için deney durumu başına üç kuyu kullanın. Bununla birlikte, en iyi örnek büyüklüğü, deney amacı ile değişir ve e belirlenmelidirmpirically. Çoklu regresyon istatistiksel testler, iki taraflı t-testi ve varyans analizi sonuçlarının istatistiksel önemi doğrulamak için kullanılabilir. Kemokinlerin seçimi Tüm tahliller göçü için olduğu gibi, kemoatraktan seçimi test hücrelerinin özelliklerini ve çalışmanın amacı tarafından dikte edilir. SDF-1 hematopoietik hücreler için iyi bilinen bir kimyasal çekicidir. Bizim ellerde, 50 ng / ml, SDF-1 &#39;lik bir konsantrasyon kemik iliğinden türetilmiş hematopoetik projenitör hücrelerin ekstravazasyon uyarmak için uygun olmuştur. Ayrıca mezenkimal kök hücreler 19 için chemoattractants olarak C3a ve bFGF kullanın. Ancak, tam ölçekli bir çalışma önce en uygun konsantrasyon aralığı tanımlamak için kemokin her kemokin ve çapraz titrasyonu kombinasyonları titre tavsiye ederiz. Belirli hücre tipleri için kemotaktik faktörlerin bir arada yararlı olabilir. Özel test hücreleri için kemokinleri con, bilinmeyen veya mevcut değilseuyarılmış lenfositler, fibroblastlar ve diğer hücrelerden ditioned ortam Kemo-çekiciler arasında bir kaynak olarak kullanılabilir. Okuma parametrelerin seçimi 3D cihazın çok yönlülük yapılabilir göçü deneyler türünü genişleyecektir ve deneylerin başarısı okuma parametrelerinin düşünceli dikkate ve tasarım bağlıdır. Bir kural olarak, hücrelerin üst (dolaşımdaki) bölmesi toplandı ve alt (statik) bölmesi hücre sayımı ile aynı anda canlılığı için test edilmelidir. Bazı hücreler mikrovasküler gözlenen fizyolojik kayma gerilmesi için düşük toleransı sahip. Bu durumda, ölü hücrelerin sayısı üst bölmesine artırılacaktır. EC katmanda (veya tuzak) tutuklandı yapışık hücre sayısını test hücreleri tarafından özellikle ifade belirteçleri immünsitokimya tarafından değerlendirilebilir. CD31 ve vWF için spesifik antikorları kullanılabilirEC tespit etmek ve test hücreleri ve AB arasında ayrımcılığa izin vermek. Buna ek olarak, EM tek tabaka bütünlüğünü her test sonunda izlenmelidir. Toplanan hücreler ile yapılan analiz türleri araştırmacılar &#39;deneysel hedeflerine bağlı olacaktır, ancak mikroarrayler ve qPCR, FACS analizi ile yüzey molekülü ifade FACS ve batı blot sinyal yollarının aktivasyonu, ve faktör gen ifade analiz değişiklikleri içerebilir ELISA ile salgı. Biz transmigrated kemik iliği hücreleri hematopoetik progenitör hücreler (Şekil 3) sıralamak için kültüre hangi kendi çalışma ile kanıtlandığı gibi fonksiyonel testlerin muazzam bir dizi, in vitro toplanan hücreleri üzerinde mümkündür. Toplanan numuneler, aynı zamanda in vivo deneyler, çeşitli test edilebilir. In vivo test hücrelerin davranışını tahmin etmek için yardımcı olabilir önemli bir parametre eğilimindedirkayma gerilmesi farklı oranlarda altında agrega oluşturmak için bazı hücrelerin ency. Örneğin, 3 boyutlu cihazda toplam oluşumu tabi tedavi hücreleri intravenöz uygulamadan sonra kümeleri oluşturmak ve in vivo (Gonçarov ve ark., Yayınlanmamış gözlemler) akut damar tıkanıklığı neden daha büyük bir eğilim olabilir. Agrega oluşumu 3D cihaz deney tamamlanması sırasında veya sonrasında test hücreleri örnekleyerek mikroskobik olarak takip edilebilir.

Hücre ekstravazasyon dolaşan hücreler kan çıkmak ve vücutta birçok fizyolojik tepkiler önemli bir bileşeni olan süreçtir. Süreç örnek olarak, doku rejenerasyonu için de önemlidir, kan damarları (veya intravenöz enjekte) içine dokulardan seferber tedavi hücreler damar yoluyla göç ve yaralanma veya dejenerasyon sitelere dolaşımını çıktığınızda. Ekstravazasyon da inflamasyon, bağışıklık ret, otoimmünite ve tümör metastazı dahil olmak üzere birçok hastalığın, patogenezinde önemli bir bileşenidir. Ekstravazasyon fizyolojik akış koşulları altında endotel hücreleri ile hücreleri (EC) dolaşımdaki etkileşimi içeren karmaşık bir çok adımlı bir işlemdir. Bu süreç (a) hücre çelik, AT luminal yüzeye (b) firma yapışma ve AB genelinde (c) göçü oluşmaktadır. Önemli olarak, ekstravazasyon kaskad her aşama c bir alt kümesi tarafından düzenlenirell tip-spesifik ve türe özel moleküller. Ancak, belirli bir hücre alt gruplarının damar dışına düzenleyen ayrıntılı moleküler mekanizmalar tam olarak büyük ölçüde kan koşulları yansıtan teknik zorluk, anlaşılamamıştır. Yeni 3D cihaz bu teknik zorlukların üstesinden gelmek ve hücre göç biyoloji anlayışımızı artıracak yapılacak deneyler izin vermek için tasarlanmıştır burada açıklanan. Hücre göçü aracılık molekülleri önemli tedavi hedeflerdir. Özel hücre tiplerinin göç kontrol moleküler olayların detaylı bir anlaşılması tedavi promosyon veya ekstravazasyon inhibisyonu için yeni hedefler belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Örneğin, yaralanma veya dejenerasyon siteleri doğru tedavi kök hücrelerin göç (, yetişkin neonatal hatta fetal dokulardan elde edilen olsun) geliştirmek müdahaleler doku rejenerasyonu büyük yarar olacaktır.Pluripotent kaynaklardan elde edilen hücreler de dahil olmak üzere tedavi kök hücreler, in vitro üretimi ve ex vivo manipüle erişkin kök hücreler (, genişletilmiş genetik manipüle ve çeşitli enzimler ile ön işlem) 1 de artan bir ilgi vardır. Böylece, terapötik amaçlar için kullanılır önce kök hücrelerin kalitesini değerlendirmek için yeni teknolojileri için bir ihtiyaç vardır. Diğer parametreler arasında, hücreler, multifokal bozuklukların tedavisinde kök hücreleri 2 arasında intravenöz gerektirebileceğinden, verimli bir şekilde dolaşım çıkmak mümkün olmalıdır. Gerçekten de, kök hücre biyolojisi mevcut zorluklardan biri son derece düşük verimlilik üstesinden gelmek için hangi doku hasarı 3-6 sitelere kök hücre ev, kök hücre göç anlayışımızda bu boşluğu konuşulması gerektiğini vurgulayarak ile. Bunun aksine, stratejiler spesifik hedef arama molekülleri hedef bloğu tarafından hücre göçü de tedavisinde yararlı olacağıinflamatuar ve oto-immün hastalıklar ve metastatik kanser gibi. Böylece, hücre göçü ve damar dışına boyunca piyasada bulunan hücreler ve AB arasındaki etkileşimleri arabuluculuk moleküler mekanizmaları anlamak öteleme tıp ve ilaç keşfi yanı sıra temel bilim alakalı. Hücre göçü farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir bir dizi yöntem yok. Ancak, bu yöntemler yeni 3D cihazla aşılabilir eksiklikleri var. Hayvan modelleri: Bu immün sistemi baskılanmış fareler ve genetik olarak manipüle fare gibi hayvan modelleri, in vivo insan hücrelerinin göç incelemek için yararlı araçlar olmuştur. Ancak, bu modeller bir önemli dezavantajı insan hücrelerinde birçok hücre yüzey molekülleri türe özgü dizisi farklılıklar nedeniyle kısmen, fare EC mevcut adezyon molekülleri ile kötü etkileşim olmasıdır. Böylece kemirgenler kullanımı çalışmainsan hücre göçü otantik insan organ-spesifik vasküler yataklarda olayları yansıtmak pek mümkün değildir. Buna ek olarak, in vivo modellerde ilaç adayları yüksek verimli tarama için uygun değildir. Homing hücre incelemek için kullanarak in vivo modellerde geleneksel zor roman homing molekülleri belirlemek ve hedef yapmak, ekstravazasyon kademeli farklı adımlar arasında ayrımcılık yok. Intravital mikroskopi yaklaşım bu ihtiyacı gidermek için geliştirilmiştir ve bilgilendirici olmuştur, ancak, bu teknik son derece zaman ve 7,8 emek yoğundur. Statik göçü deneyleri: Transwell ya da gözenekli bir membran ve çapraz Boyden odasının ölçümlerde, hücre göçü yaygın olarak göç çalışmalarında kullanılmaktadır. Tahlil, hücre aracılı kemokin göç da hücre motilitesi ve hücre-hücre dışı matris (ECM), etkileşimleri sadece incelemek için kullanılabilir ki avantajına sahiptir, fakatgözenekli zarlar yetişen bir AT tek tabaka üzerinde. Ne yazık ki, statik koşullar altında fenotip ve AT fonksiyonu fizyolojik akışı 9,10 altında olanlardan önemli ölçüde farklıdır. Böylece, Transwell deneyleri meydana gelen kemotaktik olayları sadakatle kayma stres altında göç hücreleri ve AB arasındaki etkileşimleri taklit yok. Buna ek olarak, genel sürecine seçicilik ekstra bir boyut katıyor homing çağlayan &quot;haddeleme&quot; adım, statik Transwell deneyleri oluşmaz. Bu teknoloji ile, AT tek tabaka üzerinde çeşitli kemokin aracılı hücre göçü niceliksel değerlendirilmesi izin verir iken Böylece, bu in vivo kan akışını taklit olarak kesme baskısı sağlamak için kendi yetersizlik ile sınırlıdır. Kayma stres altında Tahliller: Duvar kayma gerilmesi EC fonksiyonu 9,10 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Kesme kuvvetlerinin sinyal kaskadlar hızlı aktivasyon, transc nedenription faktörler ve EC 11,12 diferansiyel gen ekspresyonu. Bu bilgiler yapışma deneyleri bir sonraki nesil gelişmesine yol açmıştır - paralel laminer akış odaları ve kılcal - haddeleme çalışma ve kayma gerilmesi 7,13 koşulları altında EC hücrelerinin yapışma için. Bu deneyleri için sınırlayıcı faktör sadece haddeleme ve yapışma ölçebilirsiniz olduğunu, ancak göç etmek için giderdim bir yapışık hücre ve AB tek tabaka üzerinde &quot;tutuklandı&quot; ve transmigrate olmaz bir yapışık hücre arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu testlerin bir kemokin degrade doğru hücrelerinin göçü ölçemezsiniz. Çeşitli raporlar akış 14. koşullarında cam slaytlar yetişen bir AT tek tabaka altında tarama yapışık hücrelerinin yeteneği tarif var. Bu tarama tekniği şu sınırlamaları içerir: bu hücrelerin sadece sınırlı sayıda analiz, olmayan-nicel değil, matris ve cel üzerinde tarama hücre analizl yüzey değil bir kemotaktik degrade doğru göç, ve transmigrated hücreleri izole izin vermez. Bu tahlil, AT tek tabaka makaslama kuvveti uygulanarak avantajına sahip olmasına rağmen, böylece, bir kemokin gradyan doğru hücre migrasyonu ölçmek olamaz. Burada açıklanan yeni 3D teknolojisi, statik bir kemokin degrade (alt bölmesi) ile kesme kuvveti (üst bölme) birleştirerek bu eksikliklerin çoğu üstesinden gelir ve ekstravazasyon kaskad (Şekil 1) her aşamasında nicel değerlendirmesi izin verir. Cihaz aynı zamanda AK ve mikro arasındaki karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, 3B akış odası cihazı kullanmak için adım adım yöntem açıklanmaktadır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>981.0142.000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D Chamber</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FC-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gas exchange unit</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inserts</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCI-1005U</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen Bovine,Type I</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354231</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid 0.1M</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BDH3200-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HUVEC</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC- 2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &#38; cc - 4133)</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC - 3124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDF-1</td>
 <td>R7D System</td>
 <td>460-SD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extracel Trial 2.5 Kit</td>
 <td>Glycosam Byosystems</td>
 <td>GS211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibronectin, human , nature</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>356008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>A-003-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354277</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>7050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF-alfa, 10 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHC3015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td>
 <td>Southern Bioteck</td>
 <td>9519-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td># 556463</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>CB007F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>Zenbio</td>
 <td>SER - CD34-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MethoCult GF M3434</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>GFM3434</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse Methylcellulose complete media</td>
 <td>R&#38;D</td>
 <td>HSC007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td>
 <td>abcam</td>
 <td>C# ab11713</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petry dish (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA25373-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>VWR Fisher</td>
 <td>21008 - 918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flasks 75cm2</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BD353136</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cristal violet</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C-3886-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps, curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-384</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,000 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>83007-380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 - 200 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>37001-530</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>403U/VM3</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

Kan hücreleri, dolaşımdaki ekstravazasyonu kök hücre hedef arama ve tümör metastaz da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde, merkezi bir rol oynar. Üç boyutlu akış odası cihazı (bundan sonra 3 boyutlu cihaz) fizyolojik kayma gerilmesi yeniden ve hücre ekstravazasyon kaskad her adımı miktarının belirlenmesine imkân tanır in vitro teknolojisinde bir roman. 3D Cihaz ilgi hücreleri kayma gerilimi altında sirküle edildiği bir üst bölme ve ilgilenilen Kemo-atraktanlar içeren statik gözenekli bir alt bölme oluşur. Iki bölme endotel hücreleri (EC) bir tek tabaka ile kaplanmış gözenekli uçlar ile ayrılır. Ilgi microenvironmental hücreleri ile isteğe bağlı ikinci ekleme EC tabakası altında hemen yerleştirilebilir. Bir gaz değişimi birimi en uygun CO2 gerilim muhafaza sağlar ve sırasında hücreleri veya bileşikler eklemek veya çekilme için bir erişim noktası sağlardeney. Test hücreleri, bir peristaltik pompa ile kontrol istenilen kesme stresi (akış oranı) üst bölmesine dolaşır. Deneyin sonunda, dolaşan ve göç eden hücreler ileri analiz için toplanır. 3D Cihaz kemokin gradyanlar, kayma stresine direnç, kümelenme oluşumu ve hücre yaşamını tepki olarak kesme baskısı altında EC göçü ve yapışması haddeleme hücre incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, isteğe bağlı ikinci uç EC ve mikroçevredeki hücreleri arasındaki karışma etkisi incelenmiştir sağlar. 3D cihazın translasyonel uygulamaları ilaç adayları test içeren hedef hücre göçü ve damardan bir enjeksiyondan sonra hücrelerin in vivo davranış tahmin. Böylece, yeni 3D cihazın cep ekstravazasyon aracılık moleküler mekanizmaları incelemek için çok yönlü ve ucuz bir araçtır.

Fare kemik iliği kaynaklı EC hat STR-12 5 mikron gözenekli ekler üzerinde yetiştirildi. EM büyüme oranı, bir mikroskop altında kontrol edildi ve AT 100% konfluent olduğunda, ekler 3D cihazın alt bölmeye kuyu içine transfer edildi. Hemen ekler yerleştirmeden önce, alt bölmenin kuyu Kültür ortamında tek başına (negatif kontrol) ya da stromal hücre türevli faktör-1 (, 5 ng / ml ve 50 ng / ml, SDF-1) ile takviye edilmiş ortam ile doldurulmuştur. Bundan sonra, 3D Cihaz monte edildi ve protokolde tarif edildiği gibi orta bölmesi ile dolduruldu. Cihazın üst bölmesine sirküle edilecek Test hücreleri taze fare kemik iliği hücreleri (hazne başına 3.5 x 10 6 hücre) hasat edilmiştir. 0.8 dyn / cm 2 tanımlanmış bir kesme gerilimi, 0.2 ml / dk &#39;da peristaltik pompa hızını ayarlayarak uygulanmıştır. Tüm çalışma sistemi daha sonra 37 ° C ve ce de% 5 CO 2 inkübatör yerleştirildills 4 saat için AB tek tabaka ile dolaşımını ve etkileşim için izin verildi. Bu süre sonunda, dolaşımdaki hücreleri odası sökülme, toplandı ve protokolde tarif edildiği gibi ekler çıkarıldı. Transmigrated hücreler taze ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi yıkanmış alt gözleri, hasat ve koloni-oluşturucu hücre (CFC) analizi (Şekil 3), hematopoietik büyüme faktörleri ile desteklenmiş metil kültürleri aktarılmıştır. Beklendiği gibi, CFC belirgin bir şekilde daha fazla sayıda kuyu başına 5 ng / ml, SDF-1 içeren ortamda veya daha 50 ng / ml, SDF-1 içeren oyuklara EM tek tabaka üzerinde göç ettiğini bulduk. Daha önce tarif edildiği gibi, hücre göçü incelemek için kullanılabilir in vitro teknikler mevcut hiçbiri göç eden hücre ekstravazasyon desteklemek için EC yeteneği üzerindeki yerel mikro etkisini test etmek yeteneğine sahiptir. Bu, 3B cihazı ile elde edilebilir nasıl göstermek için,EM tabakası ve kemik iliği stromal hücreleri üzerinde bir tabaka hematopoetik hücreler dolaşımdaki incelenmiştir ekstravazasyon. Bunun için, stromal hücreler bir tabaka ihtiva eden bir ikinci (alt) uç alt plaka (Şekil 4), AT tek tabaka içeren, üst uç yan yana edildi. Yukarıda tarif edilen ve transmigrated hücreleri kuyulardan hasat ve sayılmıştır gibi Deney daha sonra gerçekleştirildi. Sonuçlar, AT tek tabaka altında stromal hücreler ek bir tabakanın yerleştirilmesi önemli ölçüde SDF-1 doğru hematopoietik hücreleri (Şekil 4) arasında geçiş arttığını gösterdi. Bu bulgu, yerel mikro doku hücreleri dolaşımdaki işe katkıda kavramı ile tutarlıdır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Şekil 1. 3D akış odası cihaz. A: hava geçirmez 3D cihaz, değiştirilebilir bir gözenekli membran (PM) ile ayrılmış iki bölme oluşur. EM sonra, üst ve alt bölmeler arasında bir bariyer oluşturur membran üzerinde yetiştirilir. Tanımlı kayma gerilmeleri sürekli bir infüzyon peristaltik pompa kullanılarak Perfüze medya 3D cihazının üst bölmesi uygulanır. Veya EC (AC) bağlı; dolaşan hücreleri ya olmayan etkileşim (NIC), (RC &#39;rulo&#39;) geçici AT ile etkileşim vardır. Yapışık hücrelerin bir alt cihazının (TM) bölgesinin alt statik bölmesine EM tabaka boyunca transmigrates B:. 3D cihazının bir üstten görünümünü çizimi (üst panel). . Yatay kesit görünüşünü (alt panel) üst zarı (kırmızı) konumunu, alt zar (yeşil) ve de (mavi) C altındaki gösterir: isometriDört vidayı, bir üst akrilik üst blok, bir üst oda mühür ve düşük membranlar, alt o-ring, ve 3-de akrilik alt blok D:. 3D akışının bir fotoğraf c görünüm cihazın ayrılmaz bir parçası göstermektedir peristaltik bir pompa odası ve bir gaz değişim ünitesine bağlanır. Sistem, bir steril bir başlık içinde monte edilmiş ve daha sonra bir hücre kültürü inkübatöründe aktarılır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Şekil 2. 3D cihaz sisteminin şematik. Çizim sistemi oluşturmak için gerekli olan üç durak gösterir. Kültür ortamı, peristaltik pompa tarafından oluşturulan negatif basınç girişinden içeri çekilir. Orta akışını ekler cihaza yerleştirilmesini sağlamak için Durdur # 1 kesilir. Odası kapatıldıktan sonra, pompa şalterleri olduğunutekrar dür ve odanın hemen ekler üzerinde yetiştirilen hücre kurumasını önlemek için ortam ile doldurulur. Durdurma 2. gaz alış-veriş ünitesinin yerleştirilmesini ortam sağlar. 3. durdurma akışı giriş ve çıkış bağlantısı için durdurulması için izin verir. Akış pompa üzerinde bir anahtar kullanarak gaz değişimi ünitesi ile hava kabarcıklarını çıkarmak için bir saat yönünde veya tersi yönde yönlendirilebilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Şekil 3,. 3D Cihaz fizyolojik Gerilmenin koşullarda hematopoietik progenitörlerin SDF-1-dolayımlı göçü destekler. A: Üç cihazları (alt bölmesinde her birinde 3 kuyu) montajı ve paralel olarak çalıştırılmıştır. Tek başına ortam veya 5 veya 50 ng / ml &#39;de SDF-1 içeren ortamda alt bölme oyuklara ilave edildi. Fare boNE kemik iliği hücreleri, 4 saat boyunca cihazlar dolaşmasına izin verildi. Bundan sonra, her bir cihaz sökülme ve SDF-1 (sarı) doğru transmigrated olan hücreler, alt kuyularından sayılır ve hematopoietik büyüme faktörleri (GF) ile desteklenmiş metilselüloz içinde kültürlendi. On dört gün sonra, koloniler mikroskop altında skorlandı B:. Alt bölmeleri kurtarıldı atalarıdır sayısı (koloni oluşturan hücreler, CFC) ± ortalama durumu başına üç kuyu SD olarak gösterilir. * P &lt;0.05. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Şekil 4. Hematopoietik hücrelerin ve endotel hücreler arası etkileşimleri üzerinde mikro etkisi. A: Çizim kültürlü st ile ikinci bir gözenekli membran konumunu gösterirAB ile üst membran altında romal fibroblast (SF). . Diğer kısaltmalar Şekil 1A B açıklanmıştır:. Kültürlü SF üst membran altında yerleştirildi ile ek membran (alt uç) C: Üç cihazlar (her birinde 3 kuyu) paralel olarak çalıştırılmıştır. Tek başına ortam veya 50 ng / ml, SDF-1 SDF-1 içeren ortamda alt bölme oyuklara ilave edildi. Negatif kontrol odaları SC, SDF-1, ya da her ikisi de ihmal. Kemik iliği hücreleri 37 ° C de 4 saat için dolaşmaya bırakılmıştır Bundan sonra, her bir cihaz sökülme ve transmigrated hücreleri alt bölme kuyulardan toplanmış ve sayılmıştır. Geri transmigrated hücre sayısı koşulu başına üç kuyu ± ortalama SD olarak gösterilir. * P &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions at JoVE.com

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Üç boyutlu akış odası cihaz bir roman<em&gt; In vitro</emGerilmenin fizyolojik koşullar altında dolaşan hücre ekstravazasyonu çağlayan nicel ve adım adım değerlendirilmesi için&gt; teknoloji. Cihaz bu nedenle hücre göçü temel, klinik öncesi ve klinik çalışmalar için önemli bir ihtiyaç doldurur.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Görüntüleme.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. Üç boyutlu akış odası cihaz bir roman In vitro teknoloji. Cihaz bu nedenle hücre göçü temel, klinik öncesi ve klinik çalışmalar için önemli bir ihtiyaç doldurur.

Video: A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Biyomühendislik

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Model Vocal Fold Polip'in Neden Olduğu Üç Boyutlu Akış Ayrımının Araştırılması

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Bir Polidimetilsiloksan (PDMS) Koaksiyel Akış Odak Aygıtı Kullanma Çift Emülsiyon Üretimi

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...