Bu çalışma Dr Ungrin için yeni bir araştırmacı start-up hibe altında, Calgary Üniversitesi tarafından finanse edildi.

NOT: Microwell plakaları istenen sonuçlara bağlı olarak farklı formatlarda mevcuttur. Özellikleri yanı sıra her bir biçimi kullanılmalıdır hücrelerin minimum ve maksimum sayısı için yaklaşık kurallar Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Daha küçük olan mikro-keskin bir noktaya konik ve küresel cisimler arasında değişkenlik daha küçük boyutlarda daha önemli hale gelir, ancak bu şekilde bir alt boyut sınırı vardır. Az 20, hücrelerin her biri için ortalama küremsi rutin üretimi basit 8&#39;dir. Daha büyük boyutlu mikro tam konik değildir, bu nedenle her bir kuyucuğa birden fazla daha küçük küremsi neden olabilir küçük hücre numaraları parçacıklarının oluşturulması için çalışır. AggreWell 400Ex plakaları kullanılıyorsa yüzey özellikleri nedeniyle bir miktar farklardan ötürü, sürfaktan çözeltisinin (adım 1.2) ile hazırlanması isteğe bağlı değildir. Bu protokol AggreWell 400 plakalarının kullanılması dayanmaktadır - başka biçimleri için aleyhteUlt Tablo 1. Her çukurdaki yüklenecek hücre sayısı her sfero için kümelenmiş hücrelerin sayısına göre içeren mikro oyuk sayısı çarpılarak belirlenir. Örneğin, her biri 1000 hücrelerinden sferoidler elde etmek için, her bir (1,200 kez küremsiler 1.000 hücreler her biri =) 1.2 x 10 6 hücre ile yüklenmiş olması gerekir. Hücre yoğunluğu, hücreler 0.4 ml &#39;lik bir hacim içinde yüklenir verilen hesaplanmalıdır. Bu nedenle, her 1000 hücre oluşan küremsiler, örneğin 0.4 ml 1.2 x 10 6 hücre ml için 3 x 10 6 hücre yoğunluğunda çevirir. 1.. Hücreleri Alma hazırlanıyor Mikrodelikler <ol><li> Mikro plakalar sağlanan steril, ve sadece bu tür bir laminar akışlı biyo-güvenlik kabini olarak steril bir ortamda da ambalaj çıkarılmalıdır. Sterilite protokol boyunca muhafaza edilmelidir. Kısırlık oyuklar kullanılarak su içerisinde% 70 etanol kullanılarak sterilize edilir, tehlikeye olmalıİsteğe bağlı adımları izleyerek. <ol><li> Her kuyu için, kullanılmayan% 70 etanol, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Etanol buharı hızlı bir şekilde herhangi kabarcıklarını nüfuz gerekir iken çok sayıda varsa, bunları kaldırmak için istenebilir. 2,000 x g, 2 dakika boyunca santrifüj. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında on kapak ile 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Aspire etanol. Plaka hemen hemen kullanım için steril su ya da PBS ile yıkanmış ya da depolama için hava ile kurutulabilir. </li></ol></li><li> Hücreler mikro yüzeyi ile etkileşmeyen sağlamak amacıyla, bir yüzey aktif madde kullanılarak hazırlanabilir. Genel olarak, birsonra başlangıçta bu adımı gerçekleştirmek için tavsiye ve ve yüzey-kaplanmış mikro olmaksızın üretilen sferoitleri karşılaştırın. <ol><li> Her bir oyuğa Çalkalama solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir. Bazı mikro-yakalanacak hava kabarcıkları, bu bir yandan bir sıvı ekleyerek ve daha çok yüzey üzerine dikey olarak bırakarak daha yüzeye yayılmış izin azaltılabilir, ancak. Kapağı değiştirin. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor doğru bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında kapağın üzerinde en azından otuz dakika süreyle inkübe edilir, ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Uygun bir şekilde kurumasını engellemek üzere sızdırmaz eğer gerekli olana kadar plakalar kuyularda yüzey aktif madde çözeltisi ile dört derecede muhafaza edilebilir. </li><li> , Steril su ya da kullanmak için hemen önce PBS ile plakayı yıkayın. Plakalar izin vermeyinkaplamadan sonra kurumaya. </li></ol></li></ol> 2. Hücreleri hazırlanıyor NOT: Hücre hazırlanması ile ilgili bilgiler belirli bir hücre tipi çalışılmaktadır ile biraz değişecektir. Ancak, burada tartışılan hatları, hem insan ve fare embriyonik kök hücreleri (ESC), insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC), fibroblastlar, varsayılan ilk endoderm da dahil olmak üzere hücreleri, geniş bir yelpazesi ile birlikte etkili olması için, bu koşullar gözlemledik ve stromal hücreler. Diğer gruplar mezenkimal kök hücrelerin 9 kondrogenezisi dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için başarıyla bu sistemi istihdam var, pluripotent kök hücreleri 10 nöral öncülerinin standardize nesil, toksikolojik hepatositler 11 ve semenderler 12 omurilik yenilenme değerlendirme analizleri. HT29 hücreleri ile çalışmak için özel protokol burada gösterilir. <ol><li> DMEM HT29 hücrelerinin bir T75 şişesi, başla+% 10 FBS </li><li> Aspire büyüme ortamı şişeden, tripsin ve 3 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe hücreleri </li><li> Büyüme ortamının 3 ml eklenerek tripsin sindirim durdurun. Hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın ve bir 15 ml santrifüj tüpüne kalan aktarın. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Santrifüj devam ederken, hücreleri saymak. </li><li> Aspire tripsin / orta karışımı, yukarıda hesaplanan istenen hücre yoğunluğuna göre belirlenir taze büyüme ortamı hacmi ile değiştirin. </li><li> (İSTEĞE BAĞLI) herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için bir süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu geçirin. NOT: Hücre toplama koşulları çizgiler arasındaki biraz değişecektir. , Örneğin, ilgi konusu hücreleri pasaj yapmak için uygun bir ayrışma protokol kullanılabilir, bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılmalıdır. Tripsin hassas hücre çizgileri kullanımı ile aşırı hücre ölümüne neden olabilir. Bu durumlarda biz alternatif bir dissociati olarak TrypLE kullanarak iyi sonuçlar gözlemledikreaktifi 8. Hücreler ayrışma sırasında topaklaşan olmak ve canlılığı kaybederseniz, enzim çözeltisine DNAaz eklenmesi bu sorunu çözmek olabilir. Ayrışma sürelerini azaltarak ve hücre kümeleri kırmak için bir trituration adımı kullanarak da canlılığı artırabilir. </li></ol> 3. Sfero Oluşumu Not: sferoitler hususiyetlerini ancak ilk denemeler hücreler ortam bileşiminin değiştirilmesi sonuçları bir 3-boyutlu bir kültür sistemine geçiş sonuçlarını ayırt etmek için, kültüre edildiği bir ortam kullanılarak gerçekleştirilebilir olmalıdır, orta formülasyonlar çeşitli oluşturulabilir. <ol><li> Her bir oyuğa büyüme ortamı, 0.4 ml ilave edilir. </li><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 2000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu rotor önce uygun bir santrifüj için bu hızda dengeli olmasını sağlamak için önemli olduğuna dikkat edin. </li><li> Düşük büyütme ters bir mikroskop kullanılarak, doğrulamak kabarcıklar mikro oyuk kaldırıldı. </li><li> 0.4 ml ekleyin(yukarıda hesaplanan) istenilen yoğunlukta hücre süspansiyonu. Yavaşça mikro oyuk içine hava kabarcıkları tanıtan olmadan, aşağı yukarı pipetleme karıştırın. Bu hücreler, düz bir şekilde tutarlı sferoidler elde etmek amacıyla, kuyunun boyunca dağılmasını sağlamak için önemlidir. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. Plaka santrifüj sırasında kendini düzeyde değilse, konveksiyon akımları mikro oyuk genelinde hücrelerin düzensiz dağılımı bu sonucu ortaya çıkabilir. Ağırlık plaka taşıyıcının her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış olduğu nedenle, levha, diğer levha karşı hem de dahili dengeli olmalıdır. </li></ol> NOT: düzensiz hücre dağılımı kanıt görülür ise, levha taşıyıcı üzerinde pivot noktaları için yağlama az miktarda uygulamak gerekli olabilir - yönergeler için santrifüj üreticisine başvurun. Not: hücreler, mikro oyuk içine santrifüj edildikten sonra, bunlar oldukça dirençli olanplakanın küçük hareketlerinden yıkama dışarı tant. Orta sloshing neden ani hareketler kaçınılmalıdır, ancak mikroskop santrifüj plaka veya kuvöz transferi önemli hücre değiştirmesine neden olmamalıdır. <ol start="6"><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, hücreler, mikro oyuk içinde toplanmıştır ve dengeli bir şekilde dağılmış kuyu olduğunu doğrulamak. </li><li> 37 ° C de bir gece inkübe </li><li> Bir ters mikroskop kullanılarak, küremsi oluşum sürecini gözlemlemek. Bazı hücre hatları diğerleri daha uzun sürebilir, 24 saat içinde kompakt sferoitleri oluşturacaktır. HT29 hücreleri toplamak için kümeden ilerleme, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Mikro oyuk gelen küremsilerin kurtarmak ve yavaşça bir pipetle onları jeti tarafından süspansiyon kültürü aktarmak. Seçenek olarak ise, ortam değiştirme 8 ile yerinde muhafaza sferoidler - süresi başlangıç ​​boyutu ve büyüme oranına bağlıdır, burada defOnlar meydana edildiği Mikrodelikler büyümek kadar zaman ine. <ol><li> Pasteur pipet kullanarak iyi kenarında sferoidler, aspirat orta kaybetmeden orta değiştirmek için. Yavaş yavaş menisküs sıvıyı çekmek için başlayana kadar aşağıya ucu getirmek, ve düşer gibi menisküs aşağı izleyin. Daha sonra aynı yerde iyi duvara taze ortam ilave edin. Birkaç küreler, ortam aspire edilmiş ve her zaman aynı pozisyonda değiştirilir, ancak, bu sayı tüpün içindeki çok sayıda karşılaştırıldığında küçük kalır, kaybolabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr Ungrin bir mucit olarak AggreWell teknolojisinde bir mali çıkarı var.

Bu düzgün küremsi çok sayıda farklı kaynaklardan birden fazla hücre çizgilerinden elde edilebilir, böylece bir sistem kurduk. Biz, bu koşullar altında küremsilerin birlikte bir yapışkan hücre hattı karşılaşmaya henüz. Biz daha önce ancak bugüne kadar bu sorunu tümör hatları ile ortaya çıkmadı, anoikis 5,8 eğilimli popülasyonunda hücre kaybını gözlemledik. Sistem, 24-kuyu ve 6-çukurlu formatta, hem de şu anda geliştirilmekte olan mikro-50000 içeren her prototip biyoreaktörlerde mikro oyuk tutarlı davranışı ile, bir yüzey alanına sahip isteğe bağlı olarak ölçeklenebilir. Asimetri bir endişe olabilir Sferoid olmalıdır, adım 4.8 &#39;de inkübasyon süresi iki ya da üç gün artabilir. Sferoitler hususiyetlerini aynı zamanda, ancak bu durumda başka bir bakım wi temas küremsi gibi, yeterince düşük bir kültür yoğunlukları tutmak için alınması gereken, simetri artırmak için mikro oyuk ekstre sonra bir süre için inkübe edilebilirll genellikle daha büyük yapılar halinde sigorta. Bu nedenle, daha önce bu topaklar birincil sınırlamanın, sfero büyüklüğü olmak üzere, meydana edildiği mikro oyuk içinde kültürleri korumuştur. Bu da büyüme hızı ve başlangıç ​​boyutu 8 hem de bir işlevi olduğunu ve mikro levha içinde uzatılmış kültür planlanan, bu önceden dikkate alınmalıdır. Büyümeyi engellemek için seçenekler, bu meydana gelirse, daha küçük bir küremsi başlayarak veya AggreWell 800 levhanın daha büyük mikro-kullanılarak ya da bulunmaktadır. Spheroids zamanla tutarlılık artmaya başarısız olursa, bir potansiyel nedeni hücre ölümü olabilir. Özellikle yüksek metabolik olarak aktif hücrelerin daha büyük kümeler halinde, oksijen ve temel besin teslim toplu taşıma sınırlamalar bir nekrotik iç kısım 2 neden olabilir - böyle bir yapışkan olmayan küremsi sadece aşırı hücre ölümü bir sonucu olabilir. Alternatif olarak, mekanik YÖK ölçümlerisferoitlerin sion, belirli bir hücre hattı 13&#39;ün metastaz potansiyeli ile ilişkisi, hücreler arası bağlayıcı güçleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu belki de bu tür alan oranına yuvarlaklık ve çevre gibi morfometrik parametreleri kullanarak, sfero şekil ve metastatik potansiyeli arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olurdu. Küremsiler mekanik ve morfometrik özelliklerini incelemek, ek olarak, mikro sisteminde montaj birden fazla hücre tipleri ve / veya biyomalzeme 6,7 kombinasyonlarından oluşan, karma bileşim küremsi büyük ölçekli üretimine izin verir. Diğer hücre tipleri ile tümör hücrelerinin etkileşimleri bu nedenle, örneğin, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile kombinasyon halinde tümör hücrelerinden sferoidler elde etmek için ilgi çekici olabilir, daha yakından 14 in vivo tümörlerin davranış modeli için önemlidir. Çeşitli biyomalzeme Mikropartiküller da dahil edilebilir ve SPH etkileyebilirdoğrudan hücre 7,15 ve ayrıca küremsi 16 içine büyüme faktörleri ve sitokinlerin kontrollü serbest bırakılması için rezervuar olarak ile etkileşimler yoluyla hem eroid özellikleri. Kısırlık konusunda herhangi bir ilgi vardır Bir önceki deneyin bir parçası olarak, bir kuluçka makinesi içinde bir zaman harcanan bazı oyuklar daha önce kullanılmış olan bir mikro levha ile çalışırken, örneğin oyuklar,% 70 etanol ile sterilize edilebilir su. Küreler, bir kez oluştuktan sonra, aynı zamanda bir hücre süzgecinden fazla süspansiyon geçirilmesiyle kalıntı adi hücrelerden ayrılabilir. Sferoidler muhafaza olacak ise tek tek hücreler, geçecek. Küremsi kültür boyunca, potansiyel olarak metastatik hücrelerin dökülme şüphesi varsa, bu işlem birkaç defa gerçekleştirmek istenebilecektir - ilk adi hücreleri çıkarmak için, ve daha sonra saflaştırıldı ve izole etmek içinHücrelerin d popülasyonları sferoitler tarafından verilen.

Tümör hücreleri daha fizyolojik ilgili sistem 1 için geçiş yaparken, geleneksel doku kültürü platformlarda belirlenen terapötik ajanlar etkinliğini kaybedebilir onlar zaman plastik kültüre yapmak daha üç boyutlu kültürlerde farklı davranırlar, delil artan bir vücudu var. Hem kendi temel biyoloji içgörü kazanmak için, bu şartlar altında kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için, ve aynı zamanda kliniğe tarama tesis yeni terapötik ajanlar geçme başarı oranını artırmak için istenmektedir. Uzun bir geçmişi olan biri, faydalı model sistemi tümörü küremsilerden 1,2 olarak bilinen kanser hücrelerinin üç boyutlu kümeler kullanır. İdeal olarak, küremsi oluşturulması için teknikler boyut ve bileşim deneyi tarafından kontrol edilir düzgün küremsi sayıda üretimini izin verebilir. Asılı bırak ve iyi plaka yaklaşır 3,4 bu yeniden bazı yerine getirmek mümküngerekliliklerine göre, verim genellikle sınırlıdır ve parçacıklarının çok sayıda nesil bir emek-yoğun bir görev haline gelir. Biz son zamanlarda rejeneratif tıp alanında 5 benzer zorlukları çözmek için bir sistem geliştirdik. (Bkz. Şekil 1) yoğun bir şekilde mikron çaplı bir dizi kuyucuk içinde zorunlu toplanmasını istihdam, bu yaklaşım, çok sayıda hücre türleri 6 karışımları yanı sıra çeşitli biyomalzeme 7&#39;nin dahil edilmesi de dahil olmak üzere hücre rasgele sayı, ikinci küremsiler üretilmesini sağlar. Bin ya da daha fazla yüz binlerce - - Küresel şekiller, çok sayıda teşkil edilir ve hemen özü ya da iki (yayınlanmamış gözlem) haftaya kadar en az bir 8 için ortam değişikliği ile oluşturulan edildiği mikro oyuk olarak muhafaza edilebilir. Bu sistem, bu nedenle de effe değerlendirilmesi için çok sayıda üniform ve tekrar tümör küremsiler üretimi için uygunduryeni anti-tümör maddeleri ya da temel biyolojik araştırmaların ctiveness.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Tümör sferoidler giderek üç boyutlu olarak tümör hücrelerinin davranışı için önemli bir in vitro modeli olarak kabul edilmektedir. Daha fizyolojik ilgili geleneksel yapışık sayfalık kültürlere göre, onlar daha doğru karmaşıklığını ve gerçek tümörlerde mevcut etkileşimleri özetlemek. Daha iyi tümör biyolojisi, ya da yeni terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için, bu model koşum amacıyla, kontrollü bir şekilde ve önemli sayıda, yeniden üretilebilir sferoidler elde edebilmek için gereklidir. AggreWell sistem tek bir hücre süspansiyonu santrifüj edilir içine piramit şeklinde bir mikro oyuk, yüksek yoğunluklu bir dizi oluşur. Hücrelerin sayısı, her kuyucuğa altındaki kümeleme, ve söz konusu farklı hücre tiplerinin sayısı ve oranı deneyi tarafından ortaya süspansiyonun özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Böylece, biz keyfi boyut ve kompozisyon tümör küremsiler üretebilirtemel platform teknolojisini değiştirmek gerek dışarı. Bu da kültür yüzey alanının santimetre karesi başına mikro oyuk yüzlerce son derece yüksek üretim seviyeleri, basit, nonlabor-yoğun bir işlem yoluyla elde edilebilir emin olun. Bu nedenle bu protokol tümör sfero alanındaki araştırmacılara geniş yararlı olacağını bekliyoruz.

Farklılaşan anatomik kökeni bir çok tümör hatları küremsi kolaylıkla üretilir ve süspansiyon kültürü içine ekstrakte edilebilir. 3, her koşul altında son derece düzgün bir küremsi nüfusa bu yöntem ile elde edilebilen tutarlı boyut kontrolü, Şekil göstermektedir. LNCaP prostat kanseri hücrelerinin düzensiz sınırları daha az tutarlı Sferoitlere doğurdu ise davranışlarında net arası hat farklar (mümkünse nedenlerle Tartışma bakın, keskin tanımlı sınırları ile yoğun dolu sferoitleri oluşturan HT29 kolon kanseri hücreleri ve TE6 özofagus kanseri hücreleri ile de görülebilir .) Daha tutarlı bir agrega, en güçlü iç kuvvetleri de bile yine de meydana edildiği mikro oyuk olarak daha simetrik bir biçimde, özellikle de daha büyük boyutta LNCaP agregalar, gözle görülür bir kare piramit geometrisi korumak için ise çökmesine neden Mikrodelikler. Giriş hücresi sayıları ve fizik arasındaki ilişki<html> Elde edilen sferoit olması ile nik boyutlu bir dizi değişkene bağlıdır. Hücre başına hacim ve kullanılan hücre sayısının ürün bazında teorik miktarlar da nedeniyle tek hücre süspansiyonu aşamasında hücre kaybına, hem de aşırı derecede küçük agrega kaybı, hücre kaybı azaltılabilir yetersiz komşularının numaraları ve çekirdek sınırlamalar ve nekroz taşımasından dolayı aşırı büyük agrega. Ebat da toplama işlemi sırasında oluşabilecek herhangi bir proliferasyonu ile etkilenecektir. Bu parametreler hücre hattından hücre hattına değişir gibi, özel fiziksel boyutlara küreler, arzu edilir ise tanıtmak hücre doğru sayıda deneysel olarak tespit edilmelidir. Hücre sayısında bir 8-kat artış küremsi çapı olan bir iki katına ile sonuçlanmalıdır - örneğin, birinci yaklaşım olarak, küremsi çapı dahil hücre sayısının küp kökü ile artması beklenmektedir. <html> &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; _content hep &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Şekil 1. Küremsi üretiminin şematik. Mikro sistemi hücreleri santrifüj edilebilir içine sıkı bir şekilde dolu kare piramit mikro oyuk bir dizi (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m boyutu için cm2 başına 625) oluşur. Hücreler, eğimli yan duvarlar ile bir araya getirilir ve elde edilen sferoit olması ile boyutu, kullanılan hücre süspansiyonu yoğunluğunu değiştirerek kontrol edilir. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Sferoitler halinde kümelenmiş hücre montajı. Sferoidler yedi yüz HT29 hücrelerinin her birinden meydana gelmiştir. Hemen sonra santrifüj (A), her bir kuyucuğa gevşek hücreler dibinde toplanır. Kümeler muntazam bu durumda alt sağa doğru ofset unutmayın. Bu küme boyutları dizi boyunca tutarlı kalmasını sağladı kabul edilebilir. Önemli küme boyutu farklılıklar diğer dizinin bir tarafında görülür, adım 3.5 Not bakınız. 24 saat (B) için kuluçkalamadan sonra, hücreler arası yapışma güçleri kümeleri daha sonra ekstre edilebilir tutarlı sferoidler, (C) bir araya getirir ve oluşturmak için yol açmıştır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Şekil 3,. Mikro plakalarda oluşturulan küremsi. Küremsi oluşmuş yedi yüz (A, C, E) ya da bin beş yüz (B, D, F) HT29 kolon kanseri hücreleri (A, B), LNCaP prostat kanseri hücrelerinin (C, D) veya TE6 yemek borusu kanseri hücreleri (E, F). Daha yoğun şekilde paketlenmiş HT29 ve TE6 hücreler ile karşılaştırıldığında, özellikle de gevşek bir agrega LNCaP - a preparatı içinde küremsiler tutarlılığını ve aynı zamanda hücre hatları arasında değişimini dikkat edin. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Mikrowell biçimi </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Mikrowell genişliği (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Cm2 başına Mikrodelikler </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Oyuk başına mikro- </td><td> 1.200 </td><td> 4.700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına en az hücreleri * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Kuyucuktan başına maksimum hücre * </td><td> 2.000 </td><td> 2.000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Oyuk başına en az hücre * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Oyuk başına maksimum hücre * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 -% 70 etanol hacmi (mi) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Durulama çözelti hacmi (ml) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Orta preload hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3,5 - Cep yükleme hacmi (ml) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> Bu değer, kullanılan spesifik hücrelerin boyutu ile değişecektir ve ampirik olarak belirlenmelidir * olarak kuyucuğa ortalama hücre sayıları sadece bir tahmindir </td></tr></tbody></table> Tablo 1. AggreWell seçenekleri ve protokol modifikasyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K Görüntüleme.  University of Calgary.  Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir. 

Video: Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Biyomühendislik

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Kimyasalların Üretimi<emKlebsiella pneumoniae</em&gt; Bambu Hidrolizatını Hammadde Olarak Kullanma

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...