Araştırmamız, nötrofil alt kümelerinin rolünü ve lupus gibi inflamatuar hastalıkların patogenezine nasıl katkıda bulunduklarını anlamayı amaçlamaktadır. Daha geniş bir anlamda, çalışmamız aynı zamanda insan biyolojisindeki nötrofil popülasyonlarının heterojenliğini ve bunun değişen fizyolojik durumlara bağlı olarak nasıl değişebileceğini göstermektedir. Ortaya çıkan araştırmalar, insanlardaki nötrofil popülasyonlarının heterojen olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, nötrofiller, alt tiplerin aktivasyon olmadan ve yeterli miktarda güvenilir bir şekilde izole edilmesinin zorluğu nedeniyle tek bir popülasyon olarak incelenmeye devam etmektedir. Protokolümüz, nötrofil alt tiplerinin el değmeden izolasyonu ve temel karakterizasyonu için bir yöntem sağlayarak bu sorunların üstesinden gelinmesini sağlar. Son araştırmalar, sınırlı olsa da, düşük yoğunluklu nötrofiller gibi nötrofil alt tiplerinin, hamilelik ve iltihaplanma gibi değişen fizyolojik durumların yanı sıra tüberküloz, otoimmünite ve kanser gibi hastalıklarda rol oynadığını göstermiştir.
Protokolümüz, bu hücrelerin insan sağlığına ve hastalığına katkılarına ilişkin tekrarlanabilir ve sağlam araştırmalar yapılmasını sağlayacaktır. Artık düşük yoğunluklu nötrofilleri normal yoğunluklu nötrofillerden ayırmak için test edilmiş sağlam bir protokole sahip olduğumuza göre, bu düşük yoğunluklu nötrofillerin enflamatuar koşullarda nasıl ortaya çıktığına ilişkin temel soruları yanıtlamaya odaklanıyoruz. Bunların hücre sayıları, immünofenotipleri, immünometabolizmaları ve daha fazlası açısından normal yoğunluklu nötrofillerden nasıl farklı olduğuyla özellikle ilgileniyoruz.
Başlamak için, %100 %81 %70 ve %55 izotonik çalışma çözeltileri için dört adet 50 mililitrelik konik tüpü etiketleyin %100 etiketli ilk tüpe 27 mililitre yoğunluk gradyan ortamı ekleyin, 3 mililitre 10X PBS ekleyin. Ardından, çalışma solüsyonlarının her konsantrasyonu için gerekli izotonik %100 çalışma solüsyonu hacimlerini ve 1X PBS'yi ölçün. İlgili konik borulara ekleyin.
Homojenlik için iyice karıştırmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Şimdi 15 mililitrelik konik bir tüpün dibine 3 mililitre izotonik% 81 çalışma solüsyonunu dikkatlice katman. Daha sonra yavaşça ve nazikçe 3 mililitre izotonik% 70 çalışma solüsyonunu üstüne koyun ve katmanların karışmamasını sağlayın.
Hücre ayırma tamponunu hazırlamak için,% 2 fetal sığır serumu, 1 milimol EDTA ve PBS'yi toplam 500 mililitre hacme kadar birleştirin. Homojenlik için iyice karıştırmak için pipetleyin. Kullanmadan önce tamamen yeniden askıya alındıklarından emin olmak için manyetik boncukları 30 saniye boyunca iyice sarın.
Her donör için, 4 mililitre tam kanı üç ayrı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpe alın. Her tüpe 200 mikrolitre nötrofil izolasyon kokteyli ve 200 mikrolitre manyetik boncuk pipetleyin. Reaktiflerin istenmeyen hücrelere bağlanmasını sağlamak için inkübe etmeden önce karışımı yeniden süspanse etmek için çözeltiyi nazikçe pipetleyin.
Daha sonra, hacmi 12 mililitreye çıkarmak için her tüpe hücre ayırma tamponunu ekleyin ve iyice karıştırın. Kapaksız tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve inkübe edin. Şimdi, nötrofiller içeren berrak hücre süspansiyonunu her tüpten yeni bir temiz tüpe dikkatlice aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
Ardından orijinal tüpü mıknatıstan çıkarın. Manyetik boncukları 30 saniye boyunca tekrar girdaplayın. Daha önce gösterildiği gibi yeniden süspansiyon ve inkübasyondan önce yeni aktarılan hücre süspansiyonuna 200 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.
Tüpleri kapaksız mıknatısın üzerine geri yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, izole nötrofiller içeren berrak hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın. Tam kandan elde edilen izole nötrofil süspansiyonlarını 50 mililitrelik tek bir tüpe çekin.
Hücre ayırma tamponunu kullanarak tüpü toplam 50 mililitre hacme kadar doldurun. Ara açıkken santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve nötrofil peletini 1 mililitre hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve nötrofil peletini %55 yoğunluklu gradyan ortamının 3 mililitresinde yeniden süspanse edin.
Hücre süspansiyonunu içeren 3 mililitrelik %55 yoğunluklu gradyan ortamını, gradyanın bozulmasını önleyerek önceden yapılmış yoğunluk gradyan tüplerinin üzerine yavaşça katmanlayın. Tüpleri 720 G'de 30 dakika boyunca ara kullanmadan santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, katmanları rahatsız etmemek için tüpleri dikkatli bir şekilde tutun.
Bir transfer pipeti ile, düşük ve normal yoğunluklu nötrofiller içeren ayrı katmanları dikkatlice izole edin ve bunları ayrı etiketli 15 mililitrelik tüplere aktarın. Herhangi bir artık yoğunluk gradyan ortamını yıkamak için, her 15 mililitrelik tüpe 15 mililitre işaretine kadar PBS ekleyin. Daha sonra, ara açıkken oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin.
Daha fazla deney yapmadan önce bir hemositometredeki her fraksiyondaki hücreleri sayın. Toplam nötrofillerin yoğunluk gradyan ortamı üzerinde katmanlanması, iki farklı bandın başarılı bir şekilde oluşmasıyla sonuçlandı. Düşük yoğunluklu nötrofiller bir üst bant oluşturur ve normal yoğunluklu nötrofiller bir alt bant oluşturur.
Yoğunluk gradyan ortamının mililitrede 5-6 milyon hücrenin üzerindeki nötrofillerle aşırı yüklenmesi, bantların dağınık görünmesine neden olarak alt tip karışım riskini artırdı. Ortalama izolasyon saflığı, düşük yoğunluklu nötrofiller için% 93.8 ve diğer hücre tiplerinden minimum kontaminasyon ile normal yoğunluklu nötrofiller için% 96.3 idi.
