본 연구는 호중구 부분 집합의 역할과 호중구 부분 집합이 루푸스와 같은 염증성 질환의 발병에 어떻게 기여하는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 더 넓은 의미에서, 우리의 연구는 또한 인간 생물학에서 호중구 개체군의 이질성과 이것이 다양한 생리학적 상태에 따라 어떻게 바뀔 수 있는지를 보여줍니다. 새로운 연구에 따르면 인간의 호중구 개체군은 이질적입니다.
그러나 호중구는 활성화 없이 충분한 양으로 안정적으로 아형을 분리하는 데 어려움이 있기 때문에 단일 개체군으로 계속 연구되고 있습니다. 당사의 프로토콜은 이러한 문제를 극복하기 위해 호중구 아형의 손대지 않은 분리 및 기본 특성화를 위한 방법을 제공합니다. 제한적이기는 하지만 최근의 연구에 따르면 저밀도 호중구와 같은 호중구 아형은 임신 및 염증과 같은 생리적 상태의 변화뿐만 아니라 결핵, 자가면역 및 암과 같은 질병에도 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
당사의 프로토콜은 이러한 세포가 인간의 건강과 질병에 기여하는 바에 대한 재현 가능하고 강력한 연구를 가능하게 할 것입니다. 이제 저밀도 호중구와 정상 밀도 호중구를 분리하기 위한 테스트된 강력한 프로토콜을 확보했으므로 이러한 저밀도 호중구가 염증 상태에서 어떻게 존재하는지에 관한 기본적인 질문에 답하는 데 집중하고 있습니다. 우리는 특히 이들이 세포 수, 면역 표현형, 면역 대사 등에서 정상 밀도 호중구와 어떻게 다른지에 관심이 있습니다.
시작하려면 100%81%70% 및 55%의 등장성 작업 용액에 대해 4개의 50ml 원추형 튜브에 레이블을 지정합니다.100%로 표시된 첫 번째 튜브에 27ml의 밀도 구배 매체를 추가하고 10X PBS 3밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 작업 용액의 각 농도에 대해 필요한 부피의 등장성 100% 작업 용액과 1X PBS를 측정합니다. 각각의 원뿔형 튜브에 추가하십시오.
파스퇴르 피펫을 사용하여 균질성을 위해 철저히 혼합하십시오. 이제 15 밀리리터 원추형 튜브의 바닥에 등장성 81 % 작업 용액의 3 밀리리터를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 그런 다음 천천히 부드럽게 3ml의 등장성 70% 작업 용액을 위에 겹쳐 층이 섞이지 않도록 합니다.
세포 분리 완충액을 준비하기 위해 2%의 소 태아 혈청, 1밀리몰 EDTA 및 PBS를 총 500밀리리터의 부피로 결합합니다. 균일성을 위해 철저히 혼합하는 피펫. 사용하기 전에 완전히 재현탁되도록 30초 동안 마그네틱 비드를 철저히 볼링합니다.
각 헌혈자에 대해 4ml의 전혈을 3개의 14ml 원형 바닥 튜브로 분취합니다. 각 튜브에 200마이크로리터의 호중구 분리 칵테일과 200마이크로리터의 마그네틱 비드를 피펫팅합니다. 시약이 원치 않는 세포에 결합할 수 있도록 배양 전에 용액을 부드럽게 피펫팅하여 혼합물을 재현탁시킵니다.
다음으로, 각 튜브에 세포 분리 완충액을 추가하여 12ml로 부피를 만들고 잘 섞습니다. 뚜껑이 없는 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 배양합니다. 이제 혈청학 피펫을 사용하여 각 튜브의 호중구가 포함된 투명 세포 현탁액을 새 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
그런 다음 자석에서 원래 튜브를 제거합니다. 30초 동안 자석 구슬을 다시 소용돌이칩니다. 앞서 설명한 바와 같이 재현탁 및 배양 전에 새로 이식된 세포 현탁액에 200마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가합니다.
뚜껑이 없는 자석에 튜브를 다시 놓습니다. 실온에서 10분 동안 배양한 후, 분리된 호중구를 포함하는 투명 세포 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다. 전혈에서 얻은 분리된 호중구 현탁액을 단일 50ml 튜브로 당깁니다.
세포 분리 버퍼를 사용하여 튜브를 총 부피 50ml까지 채웁니다. 브레이크를 켠 상태에서 원심분리기를 한 다음 상층액을 버리고 호중구 펠릿을 1ml의 세포 분리 완충액에 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 다시 원심분리한 후 상등액을 버리고 호중구 펠릿을 55% 밀도 구배 배지 3ml에 재현탁합니다.
세포 현탁액을 포함하는 3mL의 55% 밀도 구배 배지를 미리 만들어진 밀도 구배 튜브에 천천히 층을 이루어 구배의 방해를 방지합니다. 브레이크를 사용하지 않고 720G에서 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후에는 층을 방해하지 않도록 튜브를 조심스럽게 다루십시오.
전사 피펫을 사용하여 저밀도 및 정상 밀도 호중구가 포함된 별도의 층을 조심스럽게 분리하고 표지된 별도의 15ml 튜브로 옮깁니다. 잔류 밀도 구배 매체를 씻어내려면 각 15ml 튜브에 PBS를 최대 15ml 표시까지 추가합니다. 다음으로 브레이크를 켠 상태에서 실온에서 400G에서 5분간 원심분리합니다.
추가 실험을 하기 전에 혈구계에서 각 분획의 세포를 세십시오. 밀도 구배 매질(density gradient medium) 위에 총 호중구(total neutrophils)를 층을 이루는 것은 두 개의 뚜렷한 띠를 성공적으로 형성하는 결과를 낳았습니다. 저밀도 호중구는 상위 밴드를 형성하고 정상 밀도 호중구는 하위 밴드를 형성합니다.
밀도 구배 배지에 밀리리터당 5-600만 개 이상의 세포를 호중구로 과부하시키면 띠가 확산되어 아형 혼합의 위험이 증가했습니다. 평균 분리 순도는 저밀도 호중구의 경우 93.8%, 다른 세포 유형의 오염이 최소화된 정상 밀도 호중구의 경우 96.3%였습니다.
