Наше исследование направлено на то, чтобы понять роль субпопуляций нейтрофилов и то, как они способствуют патогенезу воспалительных заболеваний, таких как волчанка. В более широком смысле наша работа также демонстрирует гетерогенность популяций нейтрофилов в биологии человека и то, как она может меняться в зависимости от различных физиологических состояний. Новые исследования показывают, что популяции нейтрофилов у человека неоднородны.
Тем не менее, нейтрофилы продолжают изучаться как единая популяция из-за сложности надежного выделения подтипов без активации и в достаточном количестве. Наш протокол предоставляет метод нетронутой изоляции и базовой характеристики подтипов нейтрофилов, преодолевая эти проблемы. Недавние исследования, хотя и ограниченные, показали, что подтипы нейтрофилов, такие как нейтрофилы низкой плотности, играют роль в измененных физиологических состояниях, таких как беременность и воспаление, а также в таких заболеваниях, как туберкулез, аутоиммунные заболевания и рак.
Наш протокол позволит проводить воспроизводимые и надежные исследования вклада этих клеток в здоровье и болезни человека. Теперь, когда у нас есть проверенный надежный протокол для отделения нейтрофилов низкой плотности от нейтрофилов нормальной плотности, мы сосредоточимся на ответах на основные вопросы, касающиеся того, как эти нейтрофилы низкой плотности проявляются в воспалительных состояниях. Нас особенно интересует, чем они отличаются от нейтрофилов нормальной плотности по количеству клеток, иммунофенотипу, иммунометаболизму и т. д.
Для начала пометьте четыре 50 миллилитровые конические пробирки для изотонических рабочих растворов 100%81%70% и 55%Добавьте 27 миллилитров градиентной среды к первой пробирке с маркировкой 100%Добавьте 3 миллилитра 10X PBS. Далее отмеряют необходимые объемы изотонических 100% рабочих растворов и 1X PBS для каждой концентрации рабочих растворов. Добавьте его в соответствующие конические трубки.
С помощью пастеровской пипетки тщательно перемешайте для получения однородности. Теперь аккуратно выложите 3 миллилитра изотонического 81% рабочего раствора на дно 15-миллилитровой конической трубки. Затем медленно и аккуратно нанесите сверху 3 миллилитра изотонического 70% рабочего раствора, следя за тем, чтобы слои не смешивались.
Чтобы приготовить буфер для разделения клеток, соедините 2% фетальную бычью сыворотку, 1 миллимоль ЭДТА и PBS до общего объема 500 миллилитров. Пипеткой тщательно перемешать для однородности. Тщательно оберните магнитные шарики вихрем в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что они полностью ресуспендированы перед использованием.
На каждого донора насыпьте 4 миллилитра цельной крови в три отдельные 14-миллилитровые пробирки с круглым дном. Пипетка вводит в каждую пробирку 200 микролитров коктейля из изолирующих нейтрофилов и 200 микролитров магнитных шариков. Аккуратно пипетируйте раствор для ресуспендирования смеси перед инкубацией, чтобы реагенты могли связываться с нежелательными клетками.
Затем добавьте буфер для разделения клеток в каждую пробирку, чтобы довести объем до 12 миллилитров, и хорошо перемешайте. Поместите пробирки без крышек на магнитную решетку и инкубируйте. Теперь с помощью серологической пипетки осторожно перенесите суспензию прозрачных клеток, содержащую нейтрофилы, из каждой пробирки в новую чистую пробирку.
Затем снимите оригинальную трубку с магнита. Снова закрутите магнитные шарики в течение 30 секунд. Добавьте 200 микролитров магнитных шариков во вновь перенесенную клеточную суспензию перед ресуспензией и инкубацией, как было показано ранее.
Поместите пробирки обратно на магнит без крышек. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре перенесите суспензию прозрачных клеток, содержащую выделенные нейтрофилы, в новую пробирку. Соберите выделенные суспензии нейтрофилов, полученные из цельной крови, в одну 50-миллилитровую пробирку.
Долить в пробирку до общего объема 50 миллилитров с помощью буфера для разделения клеток. Центрифугируйте с включенным тормозом, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу нейтрофилов в 1 миллилитр буфера для разделения клеток. После повторного центрифугирования суспензии выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу нейтрофилов в 3 миллилитрах среды с градиентом плотности 55%.
Медленно нанесите 3 миллилитра среды с градиентом плотности 55%, содержащей клеточную суспензию, на предварительно изготовленные пробирки с градиентом плотности, избегая нарушения градиента. Центрифугируйте пробирки при 720 G в течение 30 минут, не используя перерыв. После центрифугирования обращайтесь с пробирками осторожно, чтобы не повредить слои.
С помощью переводной пипетки тщательно изолируйте отдельные слои, содержащие нейтрофилы низкой и нормальной плотности, и перенесите их в отдельные меченые 15-миллилитровые пробирки. Чтобы смыть остаточную градиентную среду, добавьте PBS в каждую 15-миллилитровую трубку до отметки 15 миллилитров. Далее центрифугируйте при 400 G в течение 5 минут при комнатной температуре с включенным перерывом.
Подсчитайте клетки в каждой фракции на гемоцитометре перед дальнейшим экспериментом. Наслоение общих нейтрофилов на среду с градиентом плотности привело к успешному образованию двух отчетливых полос. При этом нейтрофилы низкой плотности образуют верхнюю полосу, а нейтрофилы нормальной плотности образуют нижнюю полосу.
Перегрузка среды градиента плотности нейтрофилами выше 5-6 миллионов клеток на миллилитр приводила к тому, что полосы казались диффузными, увеличивая риск смешения подтипов. Средняя чистота изоляции составила 93,8% для нейтрофилов низкой плотности и 96,3% для нейтрофилов нормальной плотности с минимальным загрязнением другими типами клеток.
