Araştırmamın odak noktası, amiloid beta 1-40'ın altın nanoparçacık yüzeyi üzerinde emildiği ve geri dönüşümlü agregasyon işlemi gerçekleştiği zaman kritik doğrulama bilgilerini elde etmektir. Bu araştırma alanında karşılaştığımız zorluk, ters agregasyon işleminin termal, kimyasal ve dinamik bilgilerini elde etmektir. Bu projenin en büyük bulgusu, altın nanoparçacık yüzeyi üzerinde emildiklerinde amiloid beta 1-40'ın katlanmış veya katlanmamış onayına katkıda bulunan belirli hareket veya titreşim modunu tanımlayabilmemizdir.
Yüzey geliştirilmiş Raman saçılma spektroskopisi olan SERS'i kullanmanın en büyük avantajı, katlanmaya ve açılmaya neden olmak için kritik olan modu belirlemek için çok küçük, zayıf saçılma sinyallerini tespit etmektir. Aynı zamanda, agregaların morfolojisini tam olarak belirleyebiliyoruz. Bu projeden elde edebileceğimiz bulgular, oligomere neden olan ve fibrogeneze yol açacak olan protein-protein etkileşiminin anahtar etkileşimidir.
Başlamak için, bir mikropipet kullanarak, bir miligram liyofilize amiloid beta'ya veya A beta 1-40'a bir mililitre damıtılmış deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi yaklaşık 30 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın. Oda sıcaklığında, yaklaşık 20 santigrat derece olan çözeltide katı parçacık kalmadığından emin olun.
Daha sonra, deiyonize ve damıtılmış su kullanarak peptit stok çözeltileri hazırlayın. 275 nanometrede tirozin absorpsiyonunu spektroskopik olarak ölçerek peptit konsantrasyonunu belirleyin. A beta 1-40 stok çözeltilerini eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Veri toplamadan yaklaşık beş dakika önce peptit stok çözeltisini çözün. 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde, sekiz mikrolitre peptit çözeltisini 800 mikrolitre altın kolloidal parçacıklarla karıştırın. 4.2 mililitre deiyonize damıtılmış su ekleyin, ardından numuneyi 10 saniye boyunca girdaplayın.
A beta 1-40 peptitlerinin konsantrasyonunu 1.8 nanomolar'da sabitleyin ve peptitlerin belirli aralıktaki altın kolloidal parçacıklara oranını ayarlayın. UV görünür spektrofotometrenin sıcaklık kontrol ünitesini kullanarak, çözeltiyi oda sıcaklığına, yaklaşık 22 santigrat dereceye ayarlayın. Bir pH metre kullanarak numune çözeltisinin ilk pH'ını izleyin ve pH yedi'nin biraz altına ayarlayın.
Absorpsiyon spektrumunu 400 ila 800 nanometre aralığında toplayın. Ardından, 1.0 mikrolitrelik artışlarla 1.0 molar hidroklorik asit ekleyerek numunenin pH'ını yaklaşık pH dörde ayarlayın. Absorpsiyon spektrumunu aynı 400 ila 800 nanometre aralığında toplayın.
Ardından, yaklaşık 1,5 mikrolitrelik artışlarla 1,0 molar sodyum hidroksit ekleyerek numunenin pH'ını yaklaşık pH 10'a ayarlayın. Absorpsiyon spektrumunu 400 ila 800 nanometre arasındaki aynı dalga boyu aralığında toplayın. Bundan sonra, hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ekleyerek pH'ı pH dört ile pH 10 arasında 10 kez değiştirin.
Absorpsiyon spektrumunu sürekli olarak 25 santigrat derecede toplayın. Absorbansın bir fonksiyonu olarak dalga boylarının ASCII veri setini elde edin. Bant tepe noktalarının ortalama konumlarını çıkarmak için PeakFit programını kullanın.
Çizim işlevini kullanarak, optik yoğunluğu dalga boyunun bir fonksiyonu olarak görselleştirmek için veri kümesini çizin. Çizilen verilerdeki yaklaşık konumlarını seçerek ilk tepe dalga boylarını, lambda bir ve lambda iki olarak tanımlayın ve işaretleyin. Origin programının en yüksek sığdırma işlevini kullanarak verileri sığdırın.
XCI olarak etiketlenmiş her lambda için merkezi tepe konumlarını ve AI olarak gösterilen karşılık gelen bant alanlarını gösteren grafiği elde edin. Çıkarılan tepe konumlarını ve karşılık gelen alanları analiz için bir elektronik tablo programına aktarın. Görüntülenen formülü kullanarak bandın alanını tüm bantların toplam alanıyla karşılaştırarak her tepe merkezi için ağırlık faktörünü (AI) hesaplayın. Ardından, ekranda görüntülenen denklemi kullanarak ortalama tepe konumunu çıkarın.
Bir tersinirlik grafiği oluşturmak için, ortalama tepe konumlarını N işlem numarasının bir fonksiyonu olarak tablo haline getirin. Görüntülenen formülü kullanarak N'deki tepe konumunu analiz edin. Hesaplanan veri kümesini kaynak yazılıma aktarın ve çizin.
Analizin doğrusal olmayan eğri uydurmasını seçin, A, B, C, D ve E için başlangıç değerlerini girin ve eğri uydurma işlemini tamamlamak için çalıştır'a tıklayın. Raman görüntülemesi yapmak için, N işlem numarasındaki her numune için 100 mikrolitre çözeltiyi bir santimetre çapında bir mika diske yerleştirin. Ölçümden önce numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin.
Ardından, her işlem numarası için beyaz ışık görüntüleri toplayın N. pH sürekli olarak dört ile 10 arasında değiştiği için ayrı numuneyi yeni bir mika disk üzerinde hazırlayın. Her işlem numarası için Raman görüntüsünü toplayın ve 633 nanometre dalga boyuna sahip bir lazerin belirtilen özelliklerini kullanın. İstenen spektral bölgeye odaklanarak belirli bir entegrasyon süresine sahip 100 x 100 piksellik bir ızgarada görüntüler yakalayın.
N'nin bir fonksiyonu olarak hizalanmış her bir işlem numarası N için temsili spektrumu çizin.Beta 1-40 kaplı 20 nanometre altın için N'nin bir fonksiyonu olarak üç boyutlu yüzeyle geliştirilmiş bir Raman spektroskopisi veya SERS spektrumu oluşturun. Belirli bir pH durumuyla ilişkili belirli modları çıkarmak için spektrumun üstten görünümünü bir kontur haritası olarak kullanın. Yalnızca çift veya tek işlem sayılarında özel olarak geliştirilmiş spektral özellikleri tanımlayın.
A beta 1-40 kaplı altın nanopartiküllerin SPR bandı, çözelti daha asidik hale getirildiğinde 530 nanometreden yaklaşık 650 nanometreye kaymıştır. Bu, TEM tarafından gözlemlendiği gibi katlanmamış A beta 1-40 monomerleri ile altın kolloid agregatlarının oluşumuna karşılık geldi. A beta 1-40 kaplamalı altının pH'a bağlı renk değişimi de belirgindi.
Ortalama bandın tersinir pH'a bağlı kayması, daha kısa ve daha uzun bir dalga boyu arasında zirve yaptı ve TEM'de gözlemlenen alternatif dağınık ve agrega morfolojisi, sürecin yarı tersinir doğasını doğruladı. Beyaz ışık görüntüleme, pH kaymalarına karşılık gelen net, geri dönüşümlü bir toplanma modeli gösterirken, SERS spektrumları parmak izi bölgesinde pH'a bağlı ince değişiklikler gösterdi.
