Commencez par dissoudre 0,0005 gramme de NBT dans 10 microlitres de DMSO. Après avoir vortex pendant 15 minutes, ajouter 90 microlitres de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS avec du calcium et du magnésium et un microlitre des substances d’essai. Encore une fois, faites tourner le tube jusqu’à deux minutes.
Pour effectuer l’essai sur lame NBT, mélangez et transférez délicatement deux microlitres des neutrophiles polymorphonucléaires activés préalablement préparés sur une lame de verre propre. Incuber la lame dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de la solution de travail NBT sur les cellules.
Incuber à nouveau pendant 20 minutes à l’abri de la lumière. Après avoir séché la lame, fixez-la en appliquant une goutte de méthanol dans chaque puits pendant une minute. Colorer la lame avec 0,03 safranine pendant une minute supplémentaire.
Dans chaque puits, comptez 100 cellules aléatoires, différenciant les neutrophiles avec et sans dépôts de formazan. Pour effectuer le test de spectrophotométrie NBT, mélangez délicatement et transférez 90 microlitres de neutrophiles polymorphonucléaires activés préalablement préparés dans un tube de microcentrifugation propre. Ensuite, ajoutez soigneusement 20 microlitres d’une solution NBT de six millimolaires et incubez le tube dans l’obscurité pendant 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Après incubation, ajouter 100 microlitres de 10%SDS et Vortex. Soniser avec une pointe de sonicate à 60% d’amplitude, en ajoutant cinq cycles de 15 secondes chacun et des intervalles de 15 secondes. Centrifuger à 12 000 g pendant cinq minutes.
Transférez 60 microlitres de surnageant dans une plaque transparente à 96 puits et mesurez l’absorbance du produit surnageant à 570 nanomètres. Les résultats du test spectrophotométrique ont indiqué que 100 nanomolaires de PMA induisaient une production élevée de ROS par rapport au fMLP et aux groupes témoins. Les résultats des tests de lame NBT ont corroboré les résultats spectrophotométriques, montrant que le PMA était le stimulus induisant la production de ROS le plus intense par rapport au fMLP.
