Préparer une dilution de 12 millilitres de milieux de séparation à 60 % et 70 % dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ensuite, préparez le gradient de bas en haut en ajoutant quatre millilitres à la fois de la dilution de 60 % sur la dilution de 70 % à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Ensuite, superposez soigneusement 12 millilitres de sang hépariné sur le gradient de densité et centrifugez à 200 G pendant 15 minutes à température ambiante.
Jetez les couches de plasma et de cellules mononucléées. Ensuite, transférez soigneusement environ 7,5 millilitres de la couche au-dessus de la pastille érythrocytaire dans deux tubes coniques de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 300G pendant cinq minutes à 19 degrés Celsius.
Procédez au lavage de la pastille cellulaire avec Hanks’Balanced Salt Solution ou HBSS. Effectuez ensuite une lyse hypotonique et retirez les globules rouges restants. Après avoir éliminé le surnageant, remettre délicatement en suspension les polynucléariques dans le tampon restant et les transférer dans un microtube à centrifuger glacé.
Ensuite, transférez trois aliquotes d’un microlitre de la suspension cellulaire sur une lame de verre propre. Coloration avec panoptique rapide pour évaluer la morphologie et la pureté des cellules. Observez les cellules au microscope et comptez 300 cellules au hasard dans chaque puits.
Marquez les neutrophiles et les autres types de cellules pour évaluer la pureté de la séparation. Ensuite, transférez un microlitre de la suspension cellulaire dans 49 microlitres de colorant bleu de trypan à 0,2 % et comptez les cellules mortes et viables à l’aide d’une chambre de Neubauer. Ajustez la concentration cellulaire à 6 667 cellules par microlitre avec 50 % de plasma autologue et 50 % d’HBSS complétés par du calcium et du magnésium.
Répartissez ensuite la suspension cellulaire uniformément dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre correspondant aux conditions d’essai, y compris le témoin négatif. Préparez un système d’activation pour chaque condition, en veillant à ce que la concentration cellulaire finale reste à 6 600 neutrophiles polymorphonucléaires par microlitre. Incuber à 37 degrés Celsius sans rotation.
