Name: efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens at JoVE.com

Л. В. поддерживается NSF (IOS 1002837)

1. Создание Протопласты <ol><li> Добавить 9 мл 8% маннита в чашке Петри. </li><li> Используя лопаточку, поставить на 7 дней старый мох от 2-3 PPNH4 пластин 5 - в чашке Петри содержащие маннит. </li><li> Добавьте 3 мл 2% Driselase (Sigma D9515-25G) на чашки Петри. </li><li> Инкубировать чашки Петри при комнатной температуре с осторожном встряхивании в течение 1 часа. </li><li> Фильтры протопластов суспензии через 100 мкм сетки (BD Сокол 352 350). </li><li> Спиновые фильтруется подвески на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант. </li><li> Повторное приостановить протопластов очень нежно с 500 мкл 8% маннита. </li><li> Добавить 9,5 мл 8% маннита в пробирку. Убедитесь, что протопласты полностью приостановлено. </li><li> Повторите фильтрации и повторного взвешивания шагов (1.6, 1.7 и 1.8) еще два раза. </li><li> Возьмите 10 мкл протопластов решения и считайте протопластов в гемоцитометра. </li><li> Умножьте количество протопластов в 16 квадратных области, 10000, чтобы получить количество протопластов на мл (см. Рисунок 1). </li></ol> 2. Преобразование <ol><li> Спиновые протопластов подвески на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант. </li><li> Повторное приостановить протопластов в растворе ММГ при концентрации 1,6 млн. протопластов / мл. </li><li> Инкубируйте протопластов суспензии при комнатной температуре в течение 20 минут. </li><li> Добавить 600 мкл протопластов суспензии в пробирку, содержащие 60 мкг ДНК. Вихревые трубки мягко. </li><li> Добавить 700 мкл PEG / Ca раствора в протопластов / ДНК смеси. Вихревые трубки мягко, пока вся смесь является однородной. </li><li> Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. </li><li> В течение этого периода ожидания, крышки ПРМ-Б пластин с целлофан (80 мм диаметр круга, А. А. Упаковка Limited, Великобритания); позволяют целлофан для увлажнения на поверхности пластины, по крайней мере 5 мин. </li><li> С помощью шпателя, удалить пузырьки воздуха в ловушке между целлофан и пластины. </li><li> Развести смесь с 3 мл W5 решение. </li><li> Спиновые смеси на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант. </li><li> Повторное приостановить протопластов в топленом 2 мл PRM-T (перед добавлением к протопластов это решение может быть жидким при 42 ° С). Plate 1 мл повторно приостановить протопластов в ПРМ-Б пластина покрывается целлофан. Оберните пластин с микропоры (3M, здравоохранение). Держите пластин при 25 ° С в ростовой камере. </li><li> Кроме того, протопластов может быть повторно приостановлено в 1 мл жидкой среды, покрытия и покрытия 0,5 мл на ПРМ-Б пластины, покрытой целлофаном. Это позволяет ускорить регенерацию, но количество растений регенерирующим ниже. </li><li> Рост камере установлен на 16 час. свет и 8 часов. темно цикла. </li><li> Перемещение целлофановых на на свежем пластины выбора через 4 дня после преобразования. </li></ol> 3. Представитель Результаты: Пример преобразования показан на рисунке 2. ДНК используется в этом примере была суперспиральной 7,8 кб плазмиды проведения кассету гигромицину устойчивостью. Количество протопластов покрытием был сокращен до 50% на фотографии. Фотографии были сделаны через две недели после растения были перенесены на выбор пластин. Эффективность трансформации не зависит от концентрации ДНК до 60 мкг. Более высокие концентрации ДНК наносят ущерб эффективности преобразования. Данные показали, что этот метод обеспечивает последовательное результат в широком диапазоне ДНК количествах. Этот метод может также генерировать стабильные трансформанты эффективно, как показано в таблице 1, мы можем получить около 4 стабильные трансформанты на микрограмм линеаризованной ДНК, что значительно выше, чем сообщалось ранее 14. Мы также проверили влияние теплового шока на эффективность трансформации путем преобразования суперспиральной плазмиды проведения ген флуоресцентного белка в качестве маркера. Теплового шока было проведено через 10 минут после комнате температуры инкубации (в пределах Шаг 2.6) путем инкубирования смеси в 45 ° С водяной бане в течение 3 минут. Смесь выдерживают на водяной бане комнатной температуры сразу после теплового шока в течение 17 мин. Результаты были записаны 22 часов после преобразования. Отношения трансформантов с и без теплового шока, были очень похожи (~ 25%), но мы наблюдали негативное влияние теплового шока на жизнеспособность протопластов (данные не приведены). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Посмотреть протопластов в гемоцитометра. Разделе необходимо для протопластов подсчета обозначается красным квадратом. Обратите внимание на 16 квадратов, необходимых для подсчета протопластов (см. 1.11), изображение показывает количество протопластов 24 (240 000 клеток / мл). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Картинки из 18 дневных переходных трансформантов. Протопласты были трансформируется с указанным количеством суперспиральной плазмиды. : 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Количество ДНК (мкг) </td><td> Эффективность (tranformants / мкг ДНК) </td></tr><tr><td> 15, суперспиральной плазмиды </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, суперспиральной плазмиды </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, суперспиральной плазмиды </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, суперспиральной плазмиды </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, линеаризованной плазмиды </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Преобразование эффективности в различных количествах ДНК.

<ol>
	<li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts:+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression.">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li><li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryophytes+as+model+systems.">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li><li>Schaefer, D. G., Zr&#255;d, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li><li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens.">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li><li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moss+Physcomitrella+patens.">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li><li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens:+homologous+recombination,+concatenation+and+multiple+integration.">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth.">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li><li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun.">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li><li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens.">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li><li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li><li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements.">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li><li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss,+Physcomitrella+patens.">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li><li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Метод позволяет представленные здесь просты и последовательны ДНК превращение в Physcomitrella протопластов patens. Этот метод был первоначально разработан для Arabidopsis 1, но здесь мы продемонстрировали, что он хорошо работает с протопластов Physcomitrella patens, проще и различные растения. Поэтому этот метод может быть применен к другим видам растений с незначительными изменениями. Возможные изменения для оптимизации включают протопластов концентрация в ММГ, время инкубации в растворе ММГ и PEG / Ca. Мы решили использовать 60 мкг ДНК в наших рутинных экспериментов, так как количество трансформантов линейно возрастает с концентрацией ДНК до этого момента (табл. 1). Мы могли бы получить примерно 7000 трансформантов переходных или 200 стабильных трансформантов на одном 60 мкг ДНК трансформации, что позволяет для дальнейшего обследования и анализа большого числа растений. Преобразовано протопластов может быть либо распространяются с жидкой средой покрытие или PRM-T. Хотя эффективность регенерации ниже при жидкой среде покрытия используется, мы выбираем этот метод, когда протопластов были преобразованы с суперспиральной плазмид. Как показали в таблице 1, преобразования сделано с суперспиральной плазмидной ДНК генерировать много трансформантов и, таким образом, мы можем получить большое количество растений с жидкой средой обшивки. Кроме того, распространение протопластов с жидкой средой покрытие позволяет ускорить регенерацию, что очень важно для экспериментов с участием переходных фенотипов, таких как RNAi сбить экспериментов 9,15. Кроме того отсутствие верхней агар позволяет легко изоляции завод по иммунной и RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Ингредиент </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 мМ KH 2 PO 4 3,4 мМ Ca (NO 3) 2 1 мМ MgSO 4 2,72 ммоль диаммония тартрат 54 мкМ FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 мкМ H 3 BO 3 1,97 мкМ MnCl 2 0,4 H 2 O 0,23 мкМ CoCl 2 0,6 H 2 O 0,19 мкМ ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 мкм CuSO 4. 5H 2 O 0,10 мкМ Na 2 MoO 4 · 2H 2 O 0,168 мкМ К. И. Добавить 0,7% агар на твердой среде. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 с 6% маннита и 0,8% агара. Добавьте 10 мл 1М CaCl 2 до 1 л до заливки плиты. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 с 6% маннита и 0,6% агара. Добавить 0,5 мл 1М CaCl 2 до 50 мл перед использованием. </td></tr><tr><td> Покрытие жидкой среде </td><td> PPNH 4 с 8,5% маннита без агара. Добавить 0,5 мл 1М CaCl 2 до 50 мл перед использованием. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Добавить 4 г Driselase (Sigma D9515-25G) до 200 мл на 8% маннита. Движение на медленном огне 30 мин. при комнатной температуре, инкубировать 30 мин. при 4 ° С, и перемешать на медленном огне 5 мин. при комнатной температуре. Спиновые 2500 г в течение 10 мин, отбросить гранул. Фильтр с 0,22 мкм, и хранить замороженные в 10 мл аликвоты. Оттепель в ванну с водой комнатной температуры перед использованием. </td></tr><tr><td> ММГ </td><td> 0,4 М маннитол 15 мМ MgCl 2 4 мМ MES (рН 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 г PEG4000 3 мл H 2 O 2,5 мл 0,8 М маннитол 1 мл 1М CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 мМ NaCl 125 мМ CaCl 2 5 мМ KCl 2 мМ MES (рН 5,7) </td></tr></tbody></table>

efficient polyethylene glycol (peg) mediated transformation of the moss physcomitrella patens

Простой и эффективный способ превратить Physcomitrella pantens протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов для Physocmitrella protonemal протопласта и Arabidopsis трансформация протопластов мезофилла 1. Из-за его способности пройти эффективный митотической гомологичной рекомбинации, Physcomitrella patens стала важной модельной системой в последние годы 2. Эта способность позволяет высоких частот генов таргетинга 3-9, которые не видели в других растениях, таких как модель Arabidopsis. Чтобы воспользоваться всеми преимуществами этой системы, нам нужна эффективная и простой метод доставки ДНК в клетки мха. Наиболее распространенные способы, чтобы преобразовать эту мох бомбардировки частицами 10 и PEG-опосредованного поглощения ДНК 11. Хотя бомбардировки частицами может привести к высокой эффективности преобразования 12, ген пушки не доступны для многих лабораторий и протокол трудно стандартизировать. С другой стороны, ПЭГ опосредованной трансформации не требует специализированного оборудования, и может быть выполнена в любой лаборатории со стерильной капотом. Здесь мы покажем, простой и очень эффективный метод для трансформации протопластов мха. Этот метод может генерировать более 120 переходных трансформантов на микрограмм ДНК, что является улучшением по сравнению с наиболее эффективный протокол сообщалось ранее 13. Из-за своей простоты, эффективности и воспроизводимости, этот метод может быть применен к проектов, требующих большого числа трансформантов, а также для рутинных преобразований.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens at JoVE.com

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Простой и эффективный метод для преобразования<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal протопластов и<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Мезофильных протопластов преобразования<sup&gt; 1</sup&gt;.

Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Экологически индуцированные наследственные изменения в Лен

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Геномная Трансформация Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Тельца</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Посредника незрелых эмбрионов Преобразование непокорных кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Гиперактивный piggyBac Транспозазно-опосредованная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Естественная трансформация, экспрессия белка и криоконсервация нитевидной цианобактерии Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...