Name: stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Vi takker Bakhos A. Tannous, Ph.D., direktør for Vector Utvikling og Produksjon i Neuroscience Center of Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, for å gi oss med rAAV-eGfp vektor, og John Whang for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipend R01 NS050408 (til JS) fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag.

Den kirurgiske prosedyren beskrevet har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved Columbia University. 1. Forberedelse av utstyr og viruspartikkel Suspension <ol><li> Rengjøre og desinfisere utstyret, sterilisere kirurgiske instrumenter og V hakk spikes som skal brukes til å fikse vertebra L1. </li><li> Trekk og bevel glass pipetter. Vi bruker pipetter som har en spiss diameter på 40 um og er skrå med en vinkel på 20 °. Sterilisere glass pipetter. </li><...

<ol>
	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li><li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord.">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li><li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia.">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li><li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li><li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm.">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li><li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain.">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li><li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate.">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus.">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).</li><li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery.">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li><li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+(rAAV2/6)-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery.">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52 (2009).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li></ol>

Stereotaksiske vektor injeksjon tillater målretting ryggmargssegmenter nevroner for applikasjoner som neuronal nettverk kartlegging basert på transsynaptic viruset sprer 6,7 eller optogenetic disseksjon 8, axon veiledning under regenerering fra skade 9,10 eller genterapi for forebygging eller behandling av nevrodegenerasjon 11, 12. Virale vektorer har vært brukt til genmanipulering i ryggmargen for å studere somatosensoriske, motor og autonome trasé 9,10,13-15....

Avansert teknologi for betinget genmanipulering i musen gjør mangefasetterte tilnærminger til utforskning av synaptiske trasé og funksjonelle forbindelser i det sentrale nervesystemet. Transgener, kan reguleres ved små-molekyl effektorer som doksycyklin virker på en tetracyklin-kontrollert transactivator, som kan være konstruert for å fungere som et repressor eller en aktivator av gentranskripsjon, eller tamoxifen gjenkjenne en mutert ligand-bindende domene av østrogen reseptor 1 . Irreversible transgenet modifikasjon er ofte oppnådd ved deoksyribonukleinsyre (DNA) recombinases. CRE (årsaker rekombinasjon) og Flp (flippase rekombinasjon enzym) katalysere excision, inversjon eller translokasjon av DNA-fragmenter som er flankert av loxP (locus of krysset x over, P1) eller Frt (flippase anerkjennelse target) områder, henholdsvis 1. Bruksområder omfatter genaktivering eller taushet induserbar ribonukleinsyre (RNA) interferens <sup&gt; 2. Betinget uttrykk av fluorescerende eller enzymatisk reportere som β-galaktosidase eller alkalisk fosfatase kan brukes til å merke nevroner og undersøke deres topisk organisasjon og tilkobling 3. Store mutagenese prosjekter i Nord-Amerika ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) og Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produserer biblioteker av mus embryonale stamceller kloner med betingede genet mål og feller som til slutt vil dekke hele musa genomet. Mus som genereres fra disse kloner kan passeres med et voksende antall mus linjer som uttrykker DNA recombinases henhold arrangører eller loci som er spesifikke for en bestemt populasjon av nerveceller for selektiv genmanipulering ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; kan imidlertid begrense genmanipulering til distinkte populasjoner av nerveceller eller bestemte regioner av interesse ikke oppnås ved genetisk målretting alene hvis en promoter som er spesifikk for neuron populasjonen ikke er kjent eller ikke uttrykkes av alle nevronene i regionen av interesse. I ryggmargen, kan eksperimentelle design krever romlig begrensning av genmanipulering til ett eller to craniocaudal segmenter. Stereotaksiske injeksjon av en viral vektor som uttrykker Cre eller Flp lar deg begrense genet rekombinasjon til regioner i ryggmargen av mus der DNA-fragmenter flankert av loxP eller FRT områder, såkalte floxed eller flrted alleler. I motsetning til konstituerende DNA omorganisering, noe som ville resultere fra crossbreeding dyrene med rekombinase uttrykker mus, gir denne strategien også timelige kontroll over genet aktivering eller Silencing. Virale vektorer som koder floxed eller flørtet transgener tilby en omvendt muligheten genmanipulering i mus som uttrykker corresponding rekombinase nedstrøms et nevron-promoter. Flere rekombinante vektorer med affinitet til nevroner er tilgjengelig 4. Høy kapasitet (gutless) adenovirus, adeno-assosiert virus, herpes simplex virus og lentivirus blir ofte brukt neurotropisk vektorer. Velge riktig virus for en problemstilling er en viktig del av den eksperimentelle design. Størrelsen av transgenet, produksjonstid rute, spesifisitet av smitte til nevroner i motsetning til gliaceller, infeksjon effekt, inflammatoriske og giftig bivirkninger må vurderes 4. Her beskriver vi stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn av ryggmargen, en teknikk som vi bruker for betinget genregulering i vår forskning på nevrobiologi av smerte. Dorsalhornet mottar afferent input fra primære somatosensoriske nevroner inkludert nociceptive nerveceller. Lokale interneurons behandler informasjonen før projeksjon nevroner formidle det fradorsalhornet til hjernen 5. Vi viser smitte av dorsal horn nevroner på spinal segmentell nivå L4 med en neurotropisk rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGfp) under en konstitutivt aktiv cytomegalovirus promoter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialnavn </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td></td></tr><tr><td> Spinal bunnplate </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Små dyr stereotaksiske instrument </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Mus gassanestesi hodet holder </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Justerbare basen mounts </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V hakk pigger </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Små dyr temperaturkontroll system </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminektomi tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (en) med SYS-Micro4 Controller </td><td> Verdens Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosprøyte, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN kompresjonskoblingen, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borsilikatglass kapillærer </td><td> Verdens Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

Intraparenchymal injeksjon av en viral vektor gjør betinget genmanipulering i forskjellige populasjoner av nerveceller eller bestemte regioner i det sentrale nervesystemet. Vi viser en stereotaksiske injeksjonsteknikk som muliggjør en målrettet genuttrykk eller stanse i dorsalhornet av musen ryggmargen. Den kirurgiske prosedyren er kort. Det krever laminektomi av en enkelt vertebra, sørger for rask gjenoppretting av dyret og usvekket motilitet av ryggraden. Kontrollert injeksjon av en liten vektor suspensjon volum ved lav hastighet og bruk av en mikrosprøyte med fasettglass kanyle minimere vevet lesjonen. Den lokale immunrespons til vektoren avhenger av de iboende egenskapene til viruset benyttes, i vår erfaring, er det mindre og kortvarige når en rekombinant adeno-assosiert virus er brukt. Et rapportørgen som forbedret grønt fluorescerende protein forenkler overvåking romlige fordelingen av vektoren, og effekt og cellulære specificity av transfeksjon.

Vellykkede transfeksjon gir robust genekspresjon i nevroner av den injiserte dorsalhornet (figur 1), skåner dorsalhornet kontralaterale side, ventral horn og dorsal root ganglia. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Transfeksjon av dorsal horn nerveceller. (A) Uttrykk for den fluorescerende reporter eGfp (grønn) i venstre dorsal horn av L4 ryggmargen, to uker etter stereotaksiske injeksjon av rAAV-eGfp (serotype A...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Virale vektorer tillate målrettet genmanipulering. Vi viser en fremgangsmåte for betinget genekspresjon eller ablasjon i mus ryggmargen ved hjelp stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn, en fremtredende område av synaptiske kontakt mellom primære somatosensoriske afferenter og nevroner i sentralnervesystemet.

Stereotaksiske Injeksjon av en viral vektor for betinget genmanipulering i Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utvidelse av embryonale og voksne nevrale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation eller Viral stereotaksiske Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injeksjon av Neonatal Mouse Brain for Vedvarende og Utbredt Neuronal Transduksjon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

En Prosedyre for Implantere en Spinal Chamber for Longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxic kirurgi for genetisk manipulasjon i Striatal celler Neonatal musen hjerner

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomy og vindus kabel i mus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Direkte injeksjon av en Lentiviral vektor høydepunkter flere Motor veier i ryggmargen rotte

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...