Name: in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00
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이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.

1입니다. 준비의 잠재 식 구문
<ol><li>
이중 식 잠재 벡터에 K bZIP19 의 cDNA 클로닝 하 여 스모 E3 리가 K bZIP을 정화 (재료의 표 참조)는 N 맨끝 피토 프 태그. 우리는 (벡터-태그-K-bZIP으로 프로토콜에 걸쳐 표시) octapeptide 태그를 사용 하 여 성공을 했다. 참고: K bZIP 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 복제에 대 한 DNA 템플렛은 cDNA 역방향 doxycycline 치료20다음 TREx...

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis.">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li><li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin.">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li><li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2/3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1/CoREST1/HDAC+complex.">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li><li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation.">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).</li><li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes.">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li><li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast.">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li><li>Chang, P. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1/SAE2+and+Ubc9.">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li><li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways:+The+SUMO+lesson.">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination.">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li><li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays.">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).</li><li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li><li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-bZIP+Mediated+SUMO-2/3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation.">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).</li><li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site.">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 ?...

스모 수정 처음 단백질 안정성1을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)2. Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인9,10 또는 음수10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.
포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)13포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성14에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별15. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용16, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.
생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정17공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc918 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:853px;" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">pFastBac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td style="width:219px;">dual expression baculovirus vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR2.1-TOPO vector</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR product vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">competent cell&#160; E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:153px;">Yeastern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FYE678-80VL</td>
			<td>competent E. coli cells A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">E. coli DH10Bac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td>competent E. coli cells B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04709705001</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:153px;">NEW England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CpoI (RsrII)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bluo-gal</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1690</td>
			<td>galactosidase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">IPTG</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11605094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K0254-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">tetracyclin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">LB Broth</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">HEPES</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9888-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5136-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.13760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TRIS (Base)</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:153px;">Fonterra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">glycerol</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">2136-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0694-1L</td>
			<td>detergent A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tween 20</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0777-500ML</td>
			<td>detergent B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Poloxamer 188 solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5556-100ML</td>
			<td>detergent C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3x Flag peptide</td>
			<td style="width:153px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-FLAG m2 Magnetic beads</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8823</td>
			<td>antibody-tagged magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-1 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40120</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40220</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAGEN Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12123</td>
			<td>plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Polypropylene tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CNG3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Loading tip</td>
			<td style="width:153px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">28480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">PVDF</td>
			<td style="width:153px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEF1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Blotting filter paper</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658001 EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Pierce ECL Western Blotting</td>
			<td style="width:153px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>ECL reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">suspension mixer</td>
			<td style="width:153px;">Digisystem laboratory instruments&#160; Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Kansin instruments Co.</td>
			<td>OS701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ImageQuant LAS 4000 
			biomolecular imager</td>
			<td style="width:153px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sf9</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B82501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-p53 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-rabbit antibody</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.

제조업체에서 제공 하는 정보에 따라 E1 및 E2 효소 SUMOylation 분석 결과에서 표준 금액은 50 nM 및 500 nM, 각각. 최소한의 E2 효소 Ubc9 SUMOylate p53 수 있는 어근 먼저 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 의해 결정 되었다. 낮은 Ubc9는 표준 체 외에서 SUMOylation 분석 결과 프로토콜에 사용 금액의 1 / 5 SUMOylate p53 효율적으로 수 있었다 (그림 1A</str...

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

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