이 연구는 국립 보건원의 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원하고, NCI에 의해 UA5CA152907을 부여했다.

에어컨 미디어의 1 컬렉션은 혈관 신생 가능성을 테스트 <ol><li> 기본 또는 저 혈청 배지에서 혈관 신생 또는 항 혈관 가능성을 테스트 할 기본 또는 불후의 세포 성장 및 조절 미디어를 수집합니다. <ol><li> 또한, 사용 즉시 미디어를 조절하거나 분주하고 몇 달 동안 -80 ° C에 저장됩니다. 음성 대조군으로 nonconditioned 네이티브 또는 낮은 혈청 미디어를 사용하고, 양성 대조군으로 비 조절 완전한 성장 배지 (10 % FBS, 또는 적절한 농도)를 사용합니다. 또한, 혈관 신생의 잠재적 인 자극을 테스트하기 위해, 관심의 특정 단백질의 알려진 농도의 성장 인자가없는 보충 숯 제거 매체는 혼자 성장 인자 언론의 자유에 비교합니다. </li></ol></li></ol> 분석에 앞서 내피 세포의 2 준비 <ol><li> 분석하기 이틀 전에, 새로운 T-75 플라스크에 통과 3B-11 세포. 세포의 통로 수는 중요하다. 세포는 두 번째와 여섯 번째 통로 사이 경우이 분석은 가장 적합한. 분석은 내피 세포는 초 전이나 열째 통과 한 후에 사용하는 경우에 잘 작동하지 않습니다. </li><li> DMEM에서 24 시간 동안 세포 성장은 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg / ml의 스트렙토 마이신이 보충. </li><li> 다음과 같이 하나 일 이전에 분석에, 혈청 3B-11 세포를 굶어 : <ol><li> 3B-11 세포에서 대기음 미디어. </li><li> DMEM의 추가 감소 된 혈청 매체는 0.2 % FBS, 2 mM의 L-글루타민을, 1mM의 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg / ml의 스트렙토 마이신이 보충. </li><li> 추가로 24 시간 동안 세포를 성장. </li></ol></li></ol> 분석에 앞서 시약의 3 준비 참고 : BME 농도가 많은에 따라 매우 다양하다. 농도가 ㎖ / 따라서 BME 제조업체 보장하기 위해 제품을 구매하기 전에 문의해야 미만 10 mg의 경우 BME는 잘 작동하지 않습니다적절하게 집중을 많이 취득. <ol><li> 해동은 냉장고에 성장 인자 BME를 감소시켰다. 때 따뜻한 BME는 굳은, 그래서 그것을 사용하기 전에 차가운 유지해야합니다. BME는 몇 주 동안 냉장, 저장, 분주 및 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다. </li><li> 감소 된 성장 인자 BME 전통 BME를 통해 바람직하다. BME에 혈관 신생 인자의 부족은 쉽게 조절 매체 관 형성에 미치는 인자들로부터 효과를 관찰 할 것이다. </li><li> 해동 미디어 테스트 할 수 있습니다. </li></ol> 분석 직전에 내피 세포의 4 준비 <ol><li> 워시 3B-11 DPBS 세포. <ol><li> 또는 형광 공 촛점 현미경으로 시각화가 요구되는 경우,도 3b-11 세포를 세척하기 전에, 2 μg / ML의 최종 농도로 매질에서 내피 세포의 칼 세인 AM을 추가한다. 분석을 시작하기 전에 37 ° C와 5 % CO 2의 어둠 속에서 칼 세인 표지 세포를 놓습니다. 스톡 칼 세인을 녹여칼 세인 DMSO에 한 번 오전 0.1 %를 초과하지 않아야 DMSO의 미디어 최종 농도로 희석한다. 세포에서 30 ~ 45 분 세척 칼 세인의 AM 후 (위의 4.1 단계) 및 실험은 다음 계속합니다. </li></ol></li><li> T-75 플라스크에 1 ml의 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 Trypsinize. </li><li> 트립신 처리가 완료된 후, 100 μg이 / ㎖ 스트렙토 마이신을 최종 DMEM에서 10ML의 부피, 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1mM의 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖의 페니실린으로 세포를 재현 탁하여 트립신을 중화하고. </li><li> 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포 덩어리를 제거합니다. </li><li> 7.5 × 106 DMEM에서 세포 / ㎖, 10 % FBS, 2 mM의의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린의 최종 농도로 세포에 resuspend 셀 카운트 및 100 μg / ml의 스트렙토 마이신. </li></ol> 5 관 형성의 분석 <ol><li> 이전 BME는 프렘하지 않도록 접시를로드에 20 ~ 30 분 동안 냉장고에 또는 얼음에 24 웰 플레이트와 1 ㎖의 팁을 놓고aturely 강화. </li><li> 피펫 24 웰 플레이트의 각 웰에 감소 된 성장 인자 BME 250 μL. 분배하는 동안 최종 정지 피펫을 우울하지 않음으로써 거품을 만들지 마십시오. 충분한 BME가 잘의 중심 메 니스 커스 형태로 유지주의; 매트릭스가 너무 얇 으면, 셀은 단지 단일 층을 형성 할 것이다. </li><li> CO BME을 강화하기 위해이 30 분 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 품어 5 %. </li><li> BME가 설정되면, 재현 탁 3B-11 세포 (약 75,000 세포)의 10 μL로 에어컨 미디어의 약 300 μl를 섞는다. <ol><li> 에어컨 미디어와 사용 내피 세포 유형에 따라 도금 셀의 수의 양을 조절하고, 활성을 보여주기 위해 조절 매체의 계열 희석을 테스트. 비교 세포가 서로 다른 조건 하에서 성장 된 경우, 매체를 컨디셔닝하는데 사용 된 세포의 수를 조절 매체 볼륨을 정상화. </li></ol></li><li> 튜브 줘야리터는 2-4 시간 내에 형성하기 시작한다. 조절 된 배지에서 혈관 신생 인자의 농도에 따라 피크 관 형성은 시간 및 타이밍 분석의 3 내지 12을 최적화 할 필요가 발생할 수있다. 대신 불후의 세포의 기본 내피 세포로 작업하는 경우, 초기 관 형성은 몇 시간에 의해 지연 될 수 있습니다. <ol><li> 튜브는 종종 세포 사멸을 받게 될 것이다 18 시간 및 내피 세포 내에서 악화하기 시작합니다. </li></ol></li><li> 피크 관 형성 당시부터 잘 신중 흡 매체 BME에 튜브 네트워크를 방해하지 않도록한다. <ol><li> 1 ML의 DPBS 후 흡인 잘 각을 씻으십시오. <ol><li> 직접적인 시각화를 들어, 세포는 4.1.1로의 칼 세인 AM으로 염색 한 경우, 디지털 카메라, 또는 형광 / 공 초점 현미경에 부착 된 도립 현미경을 사용하여 각 웰 화상 튜브 네트워크에 1 ml의 신선한보기 DPBS를 추가한다. </li><li> 나중에 시각화를위한 관 네트워크를 해결하고, 각 4 % 파라 포름 알데히드를 추가하려면잘 흡입하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다. <ol><li> , 파라 포름 알데히드를 제거 DPBS로 두 번 세척 후, 각 웰에 1 ㎖에게 신선한 DPBS를 추가합니다. </li><li> 몇 튜브이 절차를 수행하는 동안 파손될 우려가 전에 고정에 현미경 이미지. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 튜브 네트워크의 6 정량화 <ol><li> 조사자의 선호도에 따라 여러 가지 방법으로 튜브 네트워크를 정량화하고, 여러 컴퓨터 프로그램은 다음의 파라미터를 측정하는 능력을 가지고 튜브의 수; 루프 / 메쉬의 수; 분기 사이트 / 노드의 수; 튜브의 길이. </li><li> 이러한 튜브 네트워크의 정량 혈관 분석기 플러그인 16 이미지 J로 대표 컴퓨터 프로그램을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. 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H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention.">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li><li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis.">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li><li>Chung, A. 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A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

혈관 신생은 생리 학적 및 병리학 적 과정에 모두 참여하고있다. 혈관 신생에 관여하는 메커니즘을 공부하는 것은 혈관 신생의 주요 단계를 요점을 되풀이 분석의 사용이 필요합니다. 내피 세포의 관 형성 어 세이 다른 분석법에 비해 여러 장점을 제공한다. 그것은, 설치하기 쉽고 상대적으로 저렴하고, 시간 내에 세관을 생산하고 정량화 할 수있다. 또한, 24 또는 96 웰 플레이트에 완료 할 수있어,...

혈관 신생, 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 발달은 1-3 치유 장기의 성장, 배아 발생 및 상처 등의 다양한 공정에 매우 중요하다. 새로 조직으로 내피 세포, 공급 산소와 영양분 줄 지어 혈관을 개발, 조혈 세포에 의한 면역 감시를 촉진하고 노폐물 2,4를 제거합니다. 혈관 신생은 배아와 태아의 개발 과정에서 핵심 중요하다. 그러나,이 과정은 상처 치유, 골격 성장, 임신의 시간 동안을 제외하고 또는 월경주기 1 ~ 3시 성인 휴면 남아있다. 지난 20 년 동안, 혈관 신생을 조절하는 핵심 분자 메커니즘이 등장하기 시작했다. 혈관 신생은 인테그린, 케모카인, 앤지 오포 이에 틴, 산소 감지 에이전트, 접합부 분자와 내인성 억제제 (5)을 포함하여 프로와 항 혈관 신생 신호로 균형 엄격하게 규제 된 이벤트입니다. proang 번이러한 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 표피 성장 인자 (EGF)와 같은 iogenic 신호는 내피 세포가 혈관 내피 세포가 기저막을 분해하는 프로테아제를 방출 수용체 활성화. 내피 세포는 하루 당 6.7 밀리미터의 속도로 콩나물을 형성, 증식 및 이주. 혈관 신생은 암, 건선, 당뇨병 성 망막 병증, 관절염, 천식,자가 면역 질환, 감염성 질환, 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 다양한 8-10 병적 상태와 관련된다. 인해 다양한 질병에서 혈관 신생의 중요성이 프로세스는 더 나은 치료제의 설계에 중요한 조절 유전자 및 경로를 이해한다. 관 형성 어 세이는 혈관 신생에 관여하는 유전자 또는 경로를 결정하기위한 신속하고 정량적 인 방법이다. 우선 1988에서 설명한이 분석의 기초 원리는 내피 세포가 혈관 신생 나누고 11-13 신호에 응답하여 급속하게 이주 할 수있는 능력을 유지하는 것이있다. 또한, 내피 세포는 분화 및 기저막 추출물 (BME)의 매트릭스에서 배양 관 형상 구조를 형성하도록 유도된다. 이 튜브는 접합부 단지를 통해 서로 연결 내피 세포에 둘러싸인 내강이 포함되어 있습니다. 관 형성은 대부분의 튜브 수량 및 혈관 신생 자극의 유형에 따라 2-6 시간 동안이 형성 분석에서 신속하게 발생한다. 내피 세포는 여러 종류의 일차 전지 및 불멸화 세포주 14,15 모두 포함이 분석을 위해 사용될 수있다. 본 문서에 사용되는 세포주는 마우스 3B-11 이었지만, 동일한 방법론은 이러한 HUVEC (인간)와 같은 세포 SVEC4-10 (마우스)와 같은 다른 내피 세포주 또는 일차 내피 세포에 적용 할 수있다. 에 따라 세포주가 사용된다 내피 CE 여부LLS가 변형 또는 비 변형되어, 최적화는 적절한 관 형성에 필요한 이상적인 시간을 식별하기 위해 수행 될 필요가있을 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

혈관 신생은 정상 조직의 발달과 상처 치료를위한 중요한 과정이지만 또한 병적 다양한 조건과 연관된다. 이 프로토콜을 이용하여, 혈관 신생은 신속하게 정량 시험 관내에서 측정 할 수있다. 차 또는 불멸화 된 내피 세포는 조절 된 매체와 혼합 기저막 매트릭스 상에 플레이 팅된다. 내피 세포는 조절 된 배지에서 발견 된 혈관 형성 신호에 반응하여 추천 모세관 구조를 형성한다. 관 형성은 혈관 내피 세포는 1 시간 및 루멘 함유 세관은 2 시간 내에 표시하기 시작하고 내 자신을 정렬하기 시작 신속하게 발생합니다. 튜브를 위상차 도립 현미경을 이용하여 가시화 될 수 있거나, 또는 세포를 형광 공 촛점 현미경 분석을 통해 시각화 및 튜브에 대한 종래의 칼 세인 AM으로 처리 될 수있다. 분기 사이트 / 노드의 수는 루프 / 메쉬, 또는 번호 또는 형성된 튜브의 길이를 쉽게 vitr에서의 측정 값으로서 정량화 될 수있다오 혈관 신생. 요약하면,이 분석은 유전자와, 빠른 재생 가능한 한 정량적 방식으로 추진 또는 혈관 신생의 억제에 관여하는 경로를 식별하기 위해 사용될 수있다.

마우스 3B-11은 내피 세포 성장 감소 응고 인자 BME에 시딩 하였다 -이 분석에서, 생성물은 사용 된 마트 리겔 - 시간이 지남에 따라. 도 1에 도시 된 바와 같이, 하나의 마우스 케 라티노 사이트 또는 섬유 아세포에서 분비되는 혈관 신생 인자는 시간에 관 형성을 유도 할 수있다. 내피 세포 마이그레이션 및 도금의 1 ~ 2 시간 내 작은 나뭇 가지를 형성하기 시작한다. 최대 관 형성 이전에 ?...

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Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.2K 조회수.  American University.  관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화. 

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Cryopreserved 샘플 복구를 위해 손수 함 장치 실수로 극저온 저장 탱크 떨어졌고

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.