Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
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저자 에릭 Fishback (데스 모인 스 행, 데스 모인 스 행, 아이오와, 미국)을 촬영 하 고 편집 하는 비디오와 함께 그의 도움에 감사 하 고 싶습니다. PS120 구와 같은 세포 안정적으로 NHE3 wt 또는 NHE3 YRK 표현 했다 친절 하 게 박사 마크 Donowitz (존스 홉킨스 대학의과 대학, 볼티모어, 메릴랜드, 미국)에 의해 제공 됩니다.

참고: 두 개의 앰프는 패치 클램핑, 전체 셀 구성 및 높은 들이 닥 침 증폭기 (에 셀을 유지 하기 위해 패치 클램프 앰프와 함께에서 자체 참조이 세 여 electroneutral 전송기의 활동을 기록 하는 데 필요한 전위 계)는이 세 통해 전송 활동을 기록 하 (재료의 표 참조). 패치 클램프 앰프 터미널 수집 보드에 직접 연결 됩니다. 전위 계는 신호를 증폭 및 필터링을 활용 하는 차동 증폭기에 연결 된다. 차동 증폭기는 터미널 수집 보드에 연결 됩니다. Capmeter, 셀 용량을 모니터링 하는 패치 클램프 소프트웨어 이전 연구20 에 사용 되었습니다 (재료의 표 참조). 녹음 실 및 관류 솔루션 37 ° c.에 유지 된다
1입니다. 펫 ISEs에 대 한 준비
<ol><li>1.2 m m의 외부 직경을 붕 규 산 유리 모 세관에서 펫을 당겨 ( 재료의 표참조) 피 펫 끌어당기는2 를 사용 하 여.</li>
	<li>폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫. 피 펫 팁의 직경은 2-3 µ m 이어야 한다.</li>
	<li>펫에 대 한 병 보유자에는 펫 피 펫 팁 ( 테이블의 자료참조)을 향하도록 넣습니다. 주의: 환기가 화학 증기 두건에서 1.4-1.6 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>Bis (dimethylamino) 디 메 틸 실 란 및 사염화 탄소 10 방울 1 방울 (~ 150 µ L)의 구성 된 siliconization 혼합물을 혼합 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>항아리에 siliconization 혼합물을 부 어 하 고 단단히 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>혼합물은 완전히 증발 때까지 실내 온도에 화학 증기 두건에서 24-48 h에 대 한 siliconization 혼합 항아리를 품 어.</li>
	<li>약 2-4 mm의 열을 만드는 백필 적절 한 이온 선택적 수 지와 피 펫. 참고: 수소 ionophore 나 칵테일 B usedfor 녹음 NHE 활동 일 수 있다 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>팁에 이온 선택적 수 지를 배포 하는 피 펫의 끝을 누르고 아래로 피 펫 피 펫 팁 용기 거치대에 세로로 배치.</li>
	<li>Checkunder 해 현미경 수 지 칵테일 팁의 끝에 도달 했습니다. 필요한 경우, 긍정적인 압력 끝에 수 지를 적용.</li>
	<li>적절 한 솔루션으로 백필 반 피 펫 (~ 100 μ). 여기,를 사용 하 여 100 mM KCl와 10 mM HEPES pH 7.0에서 ionophore 사용 하는 경우 나 칵테일 b.</li>
	<li>ISE는 전위 계에 연결 고 ISE의 팁 목욕 솔루션 기록을 위해 사용 합니다. 제로 전위 계.</li>
	<li>H+테스트-목욕 해결책의 pH를 변경 하 여 선택이 세 응답. 평균 H+-선택적 세 응답은 ~ 58 단위 pH 당 mV.</li>
	<li>주기적으로 교정에이 세 응답을 평가 합니다.</li>
</ol>2. 기록에 대 한 패치 클램프의 준비 펫
참고: 단일 채널 녹화21 에 그의 기사에서 도널드 Hilgemann에 의해 설명 하는 방법은 것이 좋습니다.
<ol><li>붕 규 산 유리 모 세관에서 거 대 한 패치에 대 한 펫을 당겨 (2.0 mmOD / 1.5 m m ID) 피 펫 끌어당기는2,,2223에.</li>
	<li>microforge를 사용 하 여 다양 한 피 펫 팁 (10-22 μ m)23을 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 장착. 구슬을 녹여 (~ 0.5 mL)는 microforge의 두꺼운 백 금 철사에 부드러운 유리의. 참고: 상대적으로 두꺼운 백 금 철사는 필요한 거 대 한 패치 펫 조작 하 (~0.5 m m).</li>
	<li>부드러운 유리 구슬 가까운 패치 피펫으로 놓고 팁 손을 떼 다 때까지 전체 열을 적용. 백 금 철사 난방 centerduring 쪽으로 약간 이동 합니다.</li>
	<li>열을 끄고 부드럽게 유리 구슬에 피 펫 팁을 밀어. 냉각 와이어 철회 하 고 피 펫 팁을 깰 것 이다.</li>
	<li>부드럽게 피 펫 팁을 원하는 직경의 피 펫 팁을 만들 열을 다시 적용 합니다. 팁의 직경에 따라 달라 집니다 수를 셀의 크기 패치 (이 연구에서 8-10 μ m).</li>
</ol>3입니다. 셀의 준비
<ol><li>워밍업 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 트립 신-EDTA 솔루션 성장 매체를 37 ° c.에 인산 염 버퍼 염 분 (PBS)</li>
	<li>PBS로 두번 세척 세포입니다. 버퍼의 1 mL를 사용 하 여 35mm 직경 셀 문화 접시.</li>
	<li>35 m m 직경 셀 문화 접시에 있는 셀에 트립 신 0.5 mL를 추가 합니다. 참고: 셀 시작 라운드-최대, 드 셀 연결 플레이트를 흔들.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 하는 완전 한 성장 매체의 5 mL (35 m m 직경 셀 문화 접시에 대 한 금액)를 추가 하 여 트립 신 작업을 중지 합니다. 참고: 트립 신에 반응 시간은 셀 종속.</li>
	<li>덩어리의 형성을 방지 하기 위해 락을 통에 세포를 놓습니다.</li>
	<li>Trypsinization 후 최대 2 시간에 대 한 셀을 사용 합니다. 참고: 시간 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>4. 내 피 펫 관류 시스템의 준비
<ol><li>석 영 튜브의 적절 한 크기로 잘라 (150 µ m OD / 75 µ m ID) 내 피 펫 관류 라인을 준비 하.</li>
	<li>200 µ L 피 펫 팁에 석 영 튜브의 한쪽을 삽입 합니다. 팁에 석 영 튜브를 접착제와 날카로운 면도날으로 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>실리콘 튜브 내 피 펫 관류 솔루션에 대 한 저수지 역할을의 작은 조각에 관류 선 (석 영 튜브 끝에 붙어)를 연결 합니다.</li>
	<li>긍정적인 압력을 만들려고 주사기에 실리콘 튜브를 연결 합니다.</li>
	<li>삽입은 관류의 피 펫 소유자의 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 석 영 튜브의 무료 끝 포트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>피 펫 솔루션 관류 라인을 평가 합니다.</li>
</ol>5입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>NHE (115 mM 칼륨 aspartate (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 m m MgCl2, 10 m m Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 m m, 12.5 m m MOPS, 관과 12.5 m m MES, pH 6.0 aspartic 산 조정)를 기록 하기 위한 무 겁 게 버퍼링된 피펫은 솔루션을 준비 합니다. 참고: 주식 피 펫 솔루션 및 필터를 준비 합니다. 녹음 전에 Mg-ATP를 추가 합니다.</li>
	<li>(140 mM NaCl, 2mm CaCl2, 2 mM MgCl2, 그리고 0.1 m m Tris HCl pH 8.2) 때마다 신선한 목욕 솔루션을 준비 합니다.</li>
</ol>6. 전송 활동의 기록
<ol><li>운송업 자 활동은 온도 의존 하기 때문에 녹음 실과 37 ° C에서 모든 솔루션을 유지 합니다.</li>
	<li>녹음 실로 셀을 놓습니다. 그들은 챔버의 바닥에 드롭 하지만 그들 챔버에 연결 하지 마십시오 때까지 기다립니다.</li>
	<li>적절 한 셀을 선택 합니다. 눈 마이크로미터와 셀의 직경을 측정 합니다. 유사한 직경을 가진 셀을 선택 합니다. 참고: 일반적으로, 큰 셀이 해야한다 더 세포 표면 및 따라서 또한 데 더 운송업 자 활동의 원형질 막에 표현 가능 하 게 더 많은 전송기. 그러나, 이건 반드시 올바른 전송 활동 특정 운송업 자 및 연구에서 셀 형식에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>탑재는 micromanipulator 하 이온 선택적 microelectrode 피 펫, 백필 세포내 솔루션 패치 클램핑 피펫으로 확인 솔루션2피 펫 끝에 도달 하면. 참고: 그것은 여러 부드러운 탭은 피 펫의 끝에 거품을 제거 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>2,,2223설정 전기 생리학의 머리 단계로 패치 클램핑 피펫으로 탑재 합니다. 참고: 그것은 중요 하다 수평 축에 45도 각도로 대 한 머리 무대에서 계속 그러면 저항력 인감의 형성에 대 한 적합 한 피 펫에 대 한 항목 각도.</li>
	<li>작은 긍정적인 압력 (~ 5 cm H2O) 패치 피 펫 팁, 차단의 기회를 줄이기 위해 목욕 솔루션으로 그것을 배치 하 게.</li>
	<li>팁 셀에 가깝다 면 패치 클램프 피 펫 이동 중지 합니다.</li>
	<li>피 펫 셀 접촉 하는 동안 긍정적인 압력을 완화 하 고 약간의 부정적인 압력 (~ 5 cm H2O)를 한 > 1000 m ω (기가 옴) 인감 패치와 세포 막에 플라스틱23.</li>
	<li>셀과 패치 피 펫이 세와 같은 초점 평면에 놓고 패치 피펫으로 ISE에 근접에 있는 셀으로 이동 (~ 5-10 µ m)2,5 는 하지만 (그림 1A)이 세를 연결할 셀 수 있도록 하지 마십시오.</li>
	<li>잠재적인 지주 0 보장 mV.</li>
	<li>전체 셀 구성을 짧은 suctions의 시리즈와 함께 인감 파열.</li>
	<li>이 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 이동 천천히 왼쪽에서 오른쪽 또는 아래로 전송 (그림 1B)의 활동을 기록 하.</li>
	<li>적어도 5-8 봉우리를 기록 (그림 1C, B A에서).</li>
	<li>구형 파 섭 물개 및 세포 막 커패시턴스 (그림 1)의 품질을 모니터링 하는 녹음 하는 동안 적용 됩니다.</li>
	<li>H+ 플럭스 예측 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) 세포 표면 및 대량 솔루션 (ΔH+) 무료 H+ 농도 차이에서 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> 참고: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> 및 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> H+ 고 확산 계수를 각각, 버퍼 BT 는 총 버퍼 농도, KD 는 버퍼의 분리 상수, r 은 셀 반경, 그리고 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> 무료 H+에 작은 변화에 대 한 바운드 H+ 의 농도에 정상 상태 변화를 결정 합니다. H+ 솔루션 무료 양성자를 나타냅니다. 이전 연구 결과와 일치 하도록 H+ 용 변환 됩니다 electrophysiological 유량 단위는 용의 현재 항목을 계산 하 여 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5].</li>
	<li>셀 크기에서 산출 될 수 있다 세포 표면 또는 막 커패시턴스 양성자 플럭스를 정상화.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

전송기의 중요 한 기능에도 불구 하 고 그들의 활동을 공부에 사용할 수 있는 방법 효과 및 불 충 분 한 있습니다. 한 가지 한계는 사용할 수 있는 방법을 측정 이온 운동 변동 세포내 이온 조성 실험4동안에 고려 하지 않고 전송 활동에 의해 중재입니다. 제시 방법 세포 외 및 세포내 이온의 정확한 제어를 보장 하 고 세포내 이온, 단백질 및 지질 구성3,<s...

이온과 플라즈마 막에 걸쳐 용액의 세포의 그리고, 따라서, 생물1의 생존을 위해 필수적 이다. 이온과 용액의 선택적 전송 전문된 채널 및 운송업 자 단백질의 배열에 의해 이루어집니다. 이 단백질에 돌연변이 다양 한 렌더링 약리 치료1채널 및 운송업 자 단백질 잠재적인 목표 임상 조건에에서 수시로 유래한 다. 불행히도, 기본 채널 및 전송 기능 및 규정 하는 메커니즘을 이해 종종 그들의 활동2,,34공부에 사용할 수 있는 방법에 의해 제한 됩니다.
특히, 전송기 분할 될 수 있다 약 하 그들은 용액의 전송 동안 세포 막 횡단 잠재력을 변경 여부에 따라 두 개의 큰 그룹으로: 변경 electrogenic 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨 인산 염 공동 수송 2a (NaPi2a), 나트륨 칼슘 교환기 (NCX), 등.] 또는 비 변경 electroneutral 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨-양성자 교환기 (NHE), 염화 나트륨 공동 전송, NaPi2c, 등.]. 전송기의 두 클래스의 활동의 방사성 동위 원소를 사용 하 여 광범위 하 게 연구 하 고 막 permeant 형광 염료2. 두 가지 방법을 특정 세포질 이온의 대량 농도 변화를 측정 하 여 전송기의 활동을 예측 하 고 두 메서드 모두 제한이, 온건한 감도 및 시간 해상도 세포내의 부적절 한 제어 등 환경입니다. 실제로, 많은 전송기의 활동 (예를 들어, NHE3, NCX), 월된 이온의 세포질 농도에 따라 달라 집니다 및 이러한 이온 농도에 변화 전송 활동2 를 조절에 중요 한 역할을 할 것으로 예상 된다 , 3 , 5. 이러한 규정적 메커니즘의 정확한 측정은 고전적인 방법을 사용 하 여 제한.
이러한 한계를 극복 하기 위해 패치 클램프 방법 전송 활동2,6를 공부 하는 데 사용 됩니다. 특히, 클램핑 시스템 패치를 함께 자체 참조 이온 선택적인 전극 (ISEs)7,8 최근 있었습니다 electroneutral 운송업 자 활동3,4 의 측정을 , 5. ISEs는 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. 이 세 하 고는 반복에 세포 막에서까지 이동, 진동 패션 (µ V)의 전압 차이 기록 합니다. 전압 차이 보급2,9Fick의 첫번째 법률을 적용 하는 교정 메서드를 사용 하 여 이온 플럭스 값으로 변환할 수 있습니다. ISEs는 사용의 밖으로 이동 하는 이온의 유출을 감지 하 세포, 두 전체 셀에 패치 클램프 방법 또는 내부 구성 막 잠재력과 세포내 이온 구성을 제어 하는 데 사용 됩니다. 또한, 응용 프로그램의 거 대 한 패치 클램프 기술 이온 뿐만 아니라 지질과 단백질3,5의 세포내 구성의 수정 수 있습니다.
요약, 패치 클램프 방법의 다양성에 비해 그 공부는 다른 방법의 운송업 자 활동 했다 패치 클램핑 다른 이러한 방법의 일반적인 한계를 극복 하기 위해 적당 한. 자체 ISEs 및 패치 클램프 기술 참조의 조합 electroneutral 전송기 긴밀 하 게 통제 된 실험 환경에서의 활동을 측정 하 고 소설 생물 분자를 독특한 가능성을 제공 합니다. 세포 막의 수송3,,45. 이 접근은 NHE의 활동 공부를 성공적으로 사용 되었습니다. 포유류 NHE 단백질 가족 세포내 양성자 (H+)10,11 안으로 나+ 그라데이션 활용에 대 한 세포 외의 나트륨 (Na+)의 electroneutral net 교환 catalyzes. 포유류, NHE 단백질 가족 11 관련된 단백질 (NHE1-9 및 NHA1-2)와 정자 특정 NHE10,,1213포함 됩니다.
NHEs (SLC9a 가족) 편 높은 진핵생물에 간단한 원핵생물에서 대부분 살아있는 유기 체에서 발견 되 고 중요 한 셀 함수10,11에 셀 염 방어 제어 등의 다양 한 참여 원핵생물, 산 기초 항상성 및 셀 볼륨을 유지 하 고 다양 한 전문된 epithelia10,12,,1415에 소금과 물을 흡수 조절 NHEs의 주요 생물학 역할 및 그들의 기능의 중요성; 여러 연구를 통해 결정 그러나, 몇 가지 연구 방법론 한계4때문에 포유류 NHEs의 속성과 분자 생물 조사 했습니다. 최근, 자체 ISEs 전체 셀 패치 클램핑 하는 동안 참조의 응용 NHE isoforms 이온, 단백질, 인지질3의 세포내 농도 있는 변화에 의해 규제의 새로운 분자 메커니즘을 밝혔다합니다 4.
특히,이 원고에 제공 된 프로토콜 설명 방법 및 활동을 연구 하 고 규제 NHE isoform 3의 (NHE3) 나+, Cl-, HCO3- 및 액체의 흡수에 중요 한 선수에 대 한 접근은 솔 국경 막 신장 및 장 epithelia14,16. 세포내 phosphoinositides에 NHE3 활동의 감도에 차이에 대 한 새로운 통찰력 (phosphatidylinositide 4, 5 bisphosphate [PI (4, 5) P2] 및 phosphatidylinositide 3,4,5 3 인산 염 [PI(3,4,5]P3]) 보고. 채널 및 전송기, 같은 세포 수송 단백질 phosphoinositides17에 의해 통제 되 고 NHE3는 직접 PI (4, 5) P2 및 P3 파이 (3,4,5)18를 바인딩합니다. 현재 문학을 바탕으로, 어느 phosphoinositide NHE35,,1819의 생리 적 또는 병 태 생리 규제에 대 한 관련 수 있습니다. 우리의 연구 결과 PI (4, 5) P2와 파이 (3,4,5) P3 NHE3 활동의 규칙에 대 한 별도 역할을 지원합니다. 이 구별이 세 기술 함께 전체 셀 패치 클램프 기록의 응용 프로그램 때문에 가능 했다. 이 기술에는 또한 NHE3 활동의 측정 하는 동안 다른 phosphoinositides의 세포내 관류를 통해 phosphoinositide 세포 내용 제어할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

세포 세포 막을 통해 이온의 수송 이온 콘텐츠 내부 및 외부 셀을 셀 생존을 위한 필수 불가결의 정밀한 제어를 보장 합니다. 이러한 전송 메커니즘 전문된 운송업 자 단백질의 활동에 의해 중재 됩니다. 특히, pH 역학 가늘게 나+같은 플라즈마 멤브레인 양성자 (H+) 압출 시스템에 의해 제어 됩니다 /H+ 교환기 (NHE) 단백질 가족. NHE 레 귤 레이 션을 기본 메커니즘을 연구를 광범위 한 노력에도 불구 하 고 NHE 가족의 속성과 분자 생물의 우리의 현재 이해 부족 하다 NHE 활동을 효과적으로 측정 하는 방법의 한정 된 가용성 때문에 . 이 원고에서는 사용 하는 H+-전체 셀 중 선택적 전극 패치 NHE 유도 H+ 플럭스 측정을 클램핑 기록. 우리는 일반적으로의 약간의 한계를 극복 하기 위해이 방법은 방사성 글귀 등 형광 막 permeants NHE 활동을 측정 하 방법을 사용을 제안 했다. 설명한 메서드를 사용 하 여 NHE 활동의 측정에는 높은 감도 및 시간 분해능 및 세포내 H+ 농도의 효율적 제어 수 있습니다. H+-선택적 전극은 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. H+-선택적 전극까지 이동 및 반복, 진동 방식에서 세포 막에서 멀리 기록 전압 차이 H+ 유량에 따라 달라 집니다. 동안 H+-선택적 전극 전체 셀 구성에서 패치 클램프 방법 세포내 이온 구성을 제어 하는 셀을 이동 하는 H+ 플럭스 감지 하는 데 사용 됩니다. 또한, 거 대 한 패치 클램프 기술 적용의 이온 뿐만 아니라 지 질의 세포내 구성의 수정 수 있습니다. NHE isoform (NHE3) 3의 운송업 자 활동 phosphoinositides에 의해 NHE3 규정의 분자 기초 연구이 기술 접근을 사용 하 여을 측정 했다.

전체 셀 패치 클램프 기록 중 자체 참조이 세는 phosphoinositides에 의해 NHE3 활동의 규칙을 공부에 적용 되었습니다. PS120 구와 같은 셀24, 생 플라즈마 멤브레인 NHEs의 표현 부족, 사용 되었다. NHE3 야생-타입 (NHE3 wt) 또는 NHE3 돌연변이 하지 않는 바인딩 phosphoinositides [티로신 501, 503 아르기닌과 리 505 알라닌, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)로 대체 했다] PS120 구와 같은 셀...

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K 조회수.  Des Moines University. 이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

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Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

연구

생물학

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

생화학

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

신경과학

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

요약

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이 비디오의 챕터

디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

나의 기능적 특성

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

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디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

나의 기능적 특성

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여