この方法は、成長調節フィトホルモンの分布に関する植物開発分野の主要な質問に答えることができます。.ジベレリンを検出する例えばnlsGPS1の遺伝的にコードされたFRETバイオセンサーを用いることによって、細胞液におけるシロイヌナプシス組織における重要な化合物の動的分布を測定することができる。一般的に、FRETバイオセンサーを分析するには、意図メトリックイメージングと比較してノイズと追加の分析ステップを増加させるレシオメトリックイメージングが含まれるため、この問題に新しい個人は苦労します。
まず、約20種の殺菌したシロイヌナズナの種を1/2のムラシゲとスクーグまたはMS寒天広場プレートにまきます。プレートを細孔外科テープで密封し、成層のために摂氏4度で1〜3日間のインキュベーションのためにアルミニウム箔で包みます。ルートイメージングの場合、示された条件下で3日間垂直方向の成長チャンバーにプレートを移します。
暗く成長した低血糖の場合は、発芽を同期させるために1〜4時間の光パルスのためにプレートを成長チャンバーに移します。その後、アルミニウム箔でプレートを包み、3日間垂直に成長室に置きます。定常状態の測定のために、きれいな顕微鏡のスライドに50マイクロリットルの模擬溶液を加え、3つの核局在性ジベレリンの知覚センサー1かnlsGPS1をスライドに静かに置く。
その後、きれいなカバースリップの各コーナーに真空グリースを落とし、苗の上に滑りをカバーするために穏やかに置きます。慎重に必要に応じて、任意の気泡を除去するために余分な模擬溶液を追加します。ジベレリン4またはGA4処理の前に、真空グリースで満たされ、1ミリメートルの直径の開口部を備えた修正された200マイクロリットルピペットチップを装備した20ミリリットルのシリンジを使用して、きれいなガラススライドに長さ3.5センチメートルの幅を均一に重ねています。
長方形の中央に50マイクロリットルの模擬溶液を加え、きれいな鉗子を使用して、コチレドンの下側で苗を発現するnlsGPS1を持ち上げ、慎重にモック溶液に移します。真空グリースの長方形の中央に実演したように、真空グリースで覆われたカバースリップを置き、苗を邪魔することなく慎重に余分な模擬溶液で貯水池を満たします。その後、エキサイティングなCFPとYFP用の適切なレーザーを搭載した共焦点顕微鏡で苗の画像を取得し、Forster共鳴エネルギー移動イメージングを行います。
治療用のGA4の場合は、顕微鏡ステージからスライドを取り外し、タイマーを20分間セットします。カバースリップの右側からモック溶液を直ちに取り外し、1/4MS液体の17マイクロモルGA4をカバースリップの左側に17マイクロリットルを添加し、すべてのモック溶液が交換されるまで取り替えます。次に、ガラススライドを顕微鏡ステージに戻し、さらに10分間待ってから、後のGA4処理画像を取得します。
目的の組織のタイムコースを設定するには、200マイクロリットルの模擬溶液をibidi付着スライドの灌流チャネルの中心に追加し、実証したようにnlsGPS1苗をモック溶液にそっと配置します。鉗子を使用して、鉗子の裏側を使用して苗の上にカバースリップをそっと置き、粘着スライドの周囲に粘着性のある材料と強い結合を形成するまで、カバースリップの外側の端をそっと押します。次に、2つの0.8ミリメートル内径エルボーエルルアーコネクタと0.8ミリメートルのシリコーンチューブの内側の直径の部分を使用して、粘着性スライドを模擬溶液で満たされた20ミリメートルのシリンジに接続し、スライドを流出溶液を収集するための出口容器に接続します。
気泡がないことを確認するためにチャンバーに十分な溶液を分配するために、プランジャーを静かに押し落とし、プログラム可能なシリンジポンプに注射器をロードします。次に、ポンプを起動してタイムコースを開始します。時間経過中のGA4治療の場合、ポンプを一時停止して灌流を停止し、注射器を含むモックバッファーをGA4で補充された4分の1のMS液体で満たされた注射器に交換します。
3D 画像解析の場合は、ファイルを IMARIS 画像解析ソフトウェア プログラムにインポートし、サーフェス ウィザードを開きます。バックグラウンド減算を 3 ミクロンに設定し、しきい値をデフォルトに設定します。核のセグメンテーション中は、近いバックグラウンドレベルのシグナルを持つ物体の信号対雑音の配給がレシオメトリック画像解析には低すぎるため、薄暗い蛍光を有する多くの核を含めないように注意してください。
次に、YFP 放出を使用して作成されたサーフェスに基づいて、CFP および FRET 放出チャネルをマスクします。XT平均強度比拡張を使用して、ドナー励起アクセクサ放出の比率を、ドナー励起ドナー放出で割った値を、2つのチャネル内の個々の表面の平均強度値の間で計算する。nlsGPS1 の放出比率で個々のサーフェスを色分けするには、統計情報を使用して色分けを選択し、平均強度比を統計タイプとして設定します。
統計アイコンの下で、テーブルから個々の値の比率をエクスポートし、データをグラフィカルに表現するためにスプレッドシートに値をコピーして貼り付けます。シロイヌナズナのルートでは、nlsGPS1の放出比勾配は、有糸学および除算ゾーンにおける低GA4レベルと後期伸長帯の高いGAレベルを示す。対照的に、発光比勾配はnlsGPS1の無応答根では観察されず、内因性GA4勾配はアーティファクトではないことを示唆している。
nlsGPS1発光比勾配は、コチルドンの低レベルと、低コチルの急速に伸びる基底領域における典型的なフックおよび高レベルの暗成長した低コチルでも形成される。これに対して、nlsGPS1非応答性低コチルでは発光率勾配は認められない。さらに、外因的に供給されたGA4は、内因性および外因性GAパターニングを研究するためにnlsGPS1を使用できることを示す、シロイヌナズナの分裂ゾーンと比較して伸び帯に優先的に蓄積する。
さらに、GA4処理nlsGPS1苗の経時解析は、除算ゾーンと比較して根伸びにおける外因性GA4のより速い蓄積を明らかにする。この手順を試みる間、イメージングパラメータを一定に保ち、サンプルの灌流中のドリフトと焦点変化の問題を最小限に抑えるために、定量イメージング中に飽和ピクセルを避けることを忘れないでください。この手順に従って、ルートチップ型制御拡散装置で成長するイメージングルーツのような、異なる速度で成長するシロイナズナプシスの根先端のGA勾配がどのように変化するか、または開発後のストレスに応じて、この技術は、植物の成長分野における研究の道を開き、追加のアラビナプソピスタリアの組織および器官におけるジベレリンの動的分布を探求する道を開いた。
