この技術は、光活性化可能なニコチン分子のレーザーフラッシュ光起きと組み合わせたマルチ光子レーザー走査顕微鏡を利用する。ニコチンコリン受容体の正確な活性化を可能にする。この技術は、ニコチン性受容体アゴニストアプリケーションに対する微細な時空間的制御を可能にし、受容体機能発現パターンおよびコリン作動性シナプスまたは体積伝達の研究のための強力なツールを提供する。
手順を開始する前に、プログラム可能なピペットプーラーを使用して、20〜40マイクロメートルの開口部径のガラスマイクロピペットを引っ張ってください。0.22ミクロンフィルターを介して約1ミリリットルの記録溶液を歪めます。そして、2ミリモルの最終濃度を得るために濾過された記録溶液に十分な凍結した光活性化ニコチンを再中断する。
引っ張られた局所適用マイクロピペットに50マイクロリットルの光活性化可能な薬物をバックフィルし、マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーにピペットを固定します。適切な長さのチューブを介してピペットホルダーを、低圧の持続性を持つ圧力放出システムに接続します。そして、マイクロマニピュレーターを使用して、局所アプリケーションピペットを細胞外記録溶液に操縦する。
ピペットチップをマウス脳組織サンプルの上にわずかに配置し、対象の細胞から約50マイクロメートルに置きます。そして簡単にピペットに圧力の平方インチあたり1〜2ポンドを適用します。関心のあるセルの変位は最小限に抑える必要があります。
安定した全細胞パッチクランプを達成した後、圧力放出装置の低い適用をオンにし、光活性化可能なニコチンで細胞を取り巻く組織を1〜2分間飽和させる。ローカル アプリケーションでは、実験がさらに複雑になります。しかし、それは化合物を惜しみ、PA-Nicのより高い濃度を利用することを可能にする。
光活性化性ニコチンの浴用途については、まず100マイクロモル最終濃度への連続再循環に適した記録溶液の体積に凍結乾燥した薬物を十分に溶解する。そして、得られた混合物を灌流系にロードする。次に、光活性化性ニコチン溶液の再循環を1.5〜2ミリメートル/分の速度で開始し、必要な再循環量を最小限に抑えるために、最小の内径と全長のチューブを使用します。
再循環中、カルボーゲンで溶液を連続的に泡立て、低照度条件下で32°Cの温度を維持します。入浴の適用はティッシュのPA-Nicの浸透の簡易性および均一性から利益を得る。しかし、それは必ずしも低いマイクロモルPA-Nic濃度を利用し、化合物のより高い総量を消費する。
内側ハベンラニューロンのライブ可視化には、透過光または赤外線差動干渉コントラスト光学とビデオカメラを使用して、安定した全細胞パッチクランプ記録を確立します。高抵抗セル接続構成を確立した後、侵入前に、セットアップとソフトウェアをレーザースキャンモードに切り替えます。侵入後、レーザースキャンを使用して、目的のイメージング色素が拡散によってニューロンを受動的に満たしていることを確認します。
色素が目的のニューロンおよび細胞内区画を視覚化するために生きスキャン機能を使用する前に、少なくとも20〜30分間細胞コンパートメントを充填することを許可します。必要に応じて、適切な設定を操作して表示ビジュアライゼーション、解像度、信号対雑音比、画像フレーム取得時間に影響を与えたり変更したりできる、ニューロンフィーチャの正確なライブビジュアライゼーションを可能にするイメージング パラメータを選択します。信号のコントラストを高めるには、ルックアップ テーブル ウィンドウを開き、ルックアップ テーブルの床と天井の設定を調整します。
組織内の対象領域を特定するには、1X 光学ズームを選択し、パンニングコントロールを使用します。Z シリーズ ツールを使用して、対象のセルを含む開始位置と終了位置を選択します。1マイクロメートルのステップサイズを設定し、最高解像度の画像を生成する画像サイズを選択します。
多くの場合、1 行あたり 1,024 x 1,024 ピクセルです。その後、連続して細胞を含むすべてのZプレーン内のニューロンを画像化します。レーザー刺激を較正するには、最小より大きいレーザーのイメージ投射力でシステムスキャンを開始し、薄い赤いマーカーの蛍光層に目的の焦点を微調整する。
蛍光フィールド内の破片をクリアし、マーカーで均等にコーティングされた領域を選択し、ツール、キャリブレーション、アライメントメニューを開いて、アンケージガルボキャリブレーション機能を選択します。2番目のガルバノミラーペアの空間キャリブレーションのための燃焼スポットチュートリアルに従い、405ナノメートルレーザー、400のレーザー刺激力、および20ミリ秒の刺激持続時間を選択します。赤いマーカーに直径1~5マイクロメートルの穴を開ける。
[更新] を選択すると、センター スポットバーン後に画像が刺激され、リフレッシュされ、赤丸のインジケーターが中心、右中央、および下中央のスポットの実際のスポット位置に移動して、9 つのスポットのグリッドを取得します。キャリブレーションをテストするには、マークポイントウィンドウを開き、サンプルの新しい領域で定義されたスポットの刺激パラメータを手動でアクティブにして、正しい最新のキャリブレーションファイルがマークポイントウィンドウにロードされることを考慮します。次に、テストパルスを適用して正しいキャリブレーションを確認します。
対象となる細胞内領域を簡単に画像化して見つけるには、ライブスキャンを選択し、光学ズームを増やして必要に応じて小さな構造を視覚化します。マークポイントを細胞膜のすぐ隣に配置し、光刺激パラメータを1~50ミリ秒の持続時間、1~4ミリワットのレーザーパワー、および少なくとも1回の試行に設定します。次に、マークポイントを選択してマークポイントプロトコルを開始し、エレクトロ生理学データ取得をリアルタイムで観察します。
光活性化可能なニコチン2PE蛍光は、実証したように局所アプリケーションピペットからの圧力放出中に容易に検出される。一方、光活性化性ニコチン光反応の主な光化学製品の送達は、同じ濃度と励起力と波長で蛍光シグナルを生成しない。光活性化性ニコチン結果の特異性を示す。
実証されたように脳組織に適用される光活性化性ニコチンのイメージングは、局所適用ピペットの100〜200マイクロメートル内の薬物の存在を明らかにする。光活性化可能なニコチンを、局所的なアプリケーションを介して脳組織に効果的に送達できることを確認する。ここでは、神経形態が完全であるように見える高品質の画像、ノイズが最小化され、破片が細胞形態の解釈を妨げない、を示す。
ただし、これらの画像は品質が低くなります。信号対バックグラウンド比が低く、破片が多いためです。脳スライス中の内側ハベヌラニューロンの2光子レーザー走査顕微鏡とPA-Nicのレーザーフラッシュ光分解を組み合わせることで、細胞形態との電気生理学的応答の調整が可能になる。
10秒間隔で単一スポット光の起用を行うと、ベースライン保持電流に十分な回復時間が可能となる。短い 1 秒間隔は、プロトコルの進行に従って保持電流の漸進的な増加につながります。ニコチンは、短い間隔でシステムから拡散するのに十分な時間を持っていないことを示唆しています。
光活性化可能な分子を利用する実験を設計する際には、蛍光指標を選択し、相性の高い励起発光スペクトルを持つ蛍光体を報告することを忘れないでください。PA-Nicは短波長の光の原因で最も一般的な蛍光性と互換性がある。最も適切なPA-Nicアプリケーション技術を選択する際には、目的のニューロンにおけるニコチン受容体の機能的発現、生理活性を慎重に検討することが重要である。
この技術の熟練した利用は、ニコチンアプリケーションの微細な時空間制御を可能にし、ニコチン受容体活性化による在来のニコチン受容体関与、細胞内局在化、および神経活動の調節の運動学を研究するためのエキサイティングな新しい可能性を可能にする。
