O uso deste protocolo para remover a variação inter-amostra pode oferecer insights sobre a regulação diferencial das macromoléculas baseadas nas discrepâncias intra-amostra entre os níveis de mRNA e proteína. Usar a mesma amostra para isolar DNA, RNA e proteína é uma tentativa de reduzir a variabilidade, melhorar a reprodutibilidade e facilitar a interpretação. Os benefícios incluem tempo e recursos economizados no momento da coleta de amostras e análise transversal de amostras valiosas e limitadas.
Para começar, sementes 1.000 ovos de minhoca em uma placa de 10 centímetros com condições de crescimento adequadas. Incubar a 20 graus Celsius por 72 horas. Em seguida, lave a placa com 5 mililitros de tampão M9 e transfira 1.000 vermes adultos para um tubo.
Centrifugar os vermes a 1.000 g por um minuto, descartar o supernascer, e transferir os vermes pelleted, com um mililitro de tampão M9, para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mililitro. Centrifugar novamente a 845 g por um minuto e descartar a maior parte do supernatante. Armazene os vermes com menos 80 graus Celsius por mais de quatro horas.
Em seguida, remova qualquer supernacido da pelota descongelada. Adicione um mililitro de reagente GTCP frio, misture bem por pipetar para cima e para baixo e coloque a amostra no gelo por 10 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio frio.
Agite o tubo vigorosamente por 15 segundos e deixe-o em temperatura ambiente por três minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 13.500 g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Com uma micro-pipeta, transfira a camada superior clara para um novo tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro sem RNase.
Transfira a camada de interfase branca nublada para um novo tubo rotulado B2 e transfira a camada rosa, da pelota restante, para um novo tubo rotulado B e coloque ambos no gelo. Separar claramente as três camadas pode ser difícil. Recomendo transferir a camada interfásica nublada para seu próprio tubo em vez de precipitar o DNA desta camada da camada orgânica ou rosa.
Para isolar o RNA, primeiro adicione 500 microliters de 100% isopropanol ao tubo A para precipitar o RNA. Em seguida, incubar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, centrifugar o tubo a 13.500 g a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, descarte o supernasal e adicione um mililitro de 75% de etanol ao tubo A para lavar a pelota. Centrifugar o tubo a 5.300 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e deixe o ar de pelota secar por cinco a 10 minutos.
Adicione 50 microliters de água sem RNase para reconstituir a pelota de RNA e incubar a pelota a 55 a 60 graus Celsius por 10 minutos para dissolvê-la. Por fim, use um espectótmetro para medir a concentração do RNA isolado em 260 nanômetros e identificar quaisquer impurezas em 230 e 280 nanômetros. Para isolar o DNA, primeiro adicione 300 microlitadores de 100% etanol à fase orgânica do tubo B e à camada branca nublada no tubo B2 para precipitar o DNA, misturar por inversão e deixar os tubos em temperatura ambiente por dois a três minutos.
Em seguida, tubos de centrífugas B e B2 a 376 g a 4 graus Celsius por cinco minutos para pelotar DNA. Combine o supernascido dos tubos B e B2 em um novo tubo de dois mililitros rotulado C e deixe-o no gelo para posterior isolamento de proteínas. Em seguida, lave a pelota de DNA no tubo B2 com um mililitro de 0,1 citrato de sódio molar em 10% de etanol por 30 minutos.
Tubo de centrífuga B2 a 376 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Repita a etapa de lavagem e suspenda novamente a pelota em 1,5 mililitros de 75% de etanol e deixe-a em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, tubo de centrífuga B2 a 376 g a quatro graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, descartar o supernasal e permitir que a pelota seque por cinco a 10 minutos.
Dissolva a pelota em 150 microlitres de oito mililitros de hidróxido de sódio. Em seguida, centrifugar a amostra a 376 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Finalmente, com uma micropipette, transfira o supernatante contendo o DNA para um novo tubo.
Use um espectótmetro para medir a concentração do DNA isolado em 260 nanômetros e identificar quaisquer impurezas em 230 e 280 nanômetros. Para precipitar a proteína, primeiro adicione 1,5 mililitros de 100% isopropanol ao supernanato rosa no tubo C, misture invertendo várias vezes e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, tubo de centrífuga C a 13.500 g a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernasce e lave a pelota com dois mililitros de 0,3 cloridrato de guanidina molar em 95% de etanol por 20 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar o tubo novamente a 5.300 g a quatro graus Celsius por cinco minutos e repetir o passo de lavagem como antes. Transfira a pelota de proteína para um novo tubo de 1,5 mililitro rotulado C2 e adicione 1,5 mililitros de 95% de etanol, vórtice, e deixe-o sentado à temperatura ambiente por 20 minutos.
Centrifugar o tubo a 5.300 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e deixe a pelota secar à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, dissolva a pelota em 300 microliters de 5%SDS a 50 graus Celsius por 60 minutos.
Finalmente, centrifugar o tubo a 13.500 g a 17 graus Celsius por 10 minutos. E transfira o supernante contendo a proteína para um novo tubo. Para realizar uma transcrição reversa quantitativa PCR.
Primeiro, use um nanograma do RNA isolado para preparar cDNA por transcrição reversa. Para fazer uma placa de estoque de cDNA, adicione 100 microliters de uma a 100 diluições de cada amostra de CDNA a poços individuais de uma placa de poço de 96, inclua controles apropriados, como poços somente água e amostras diluídas em série, para estabelecer a eficiência do primer para cada gene. Para fazer uma mistura mestre para cada conjunto de primers, adicione sete microlitros de água, um corante de cianeto intercalante de DNA, e cinco micro-molares cada um de primers para frente e reverso.
Adicione sete microliters da mistura mestre aos poços apropriados de uma placa RT-qPCR. Em seguida, adicione três microlitros do cDNA da placa de estoque e execute a placa usando um protocolo RT-qPCR adequado para os primers que estão sendo usados. A análise rt-qPCR de mRNAs isolados de quatro amostras independentes de três cepas de vermes foi feita para confirmar os alvos identificados pelo ensaio RNA seq.
O gene F07C4.12 foi regulado em ambos os ensaios em vermes eat-2, mas sua regulação em vermes rsks-1 não foi detectada pelo ensaio RT-qPCR. Além disso, as alterações de expressão detectadas por RNA seq de mrp-1 nos vermes eat-2 e rsks-1 foram confirmadas via RT-qPCR. A regulação ou a regulação de genes marcadores de organela em vermes mutantes também foram detectadas pela análise RT-qPCR.
A comparação da proteína extraída gtcp versus RIPA em vermes separados pela página da SDS e manchados com azul coomassie mostrou uma qualidade semelhante com melhor resolução de proteínas maiores para proteínas extraídas pelo GTCp. A análise de manchas ocidentais mostrou níveis de proteína semelhantes na maioria dos casos;no entanto, as proteínas maiores que 75 kilodalton apresentaram níveis mais baixos na proteína extraída pelo RIPA. A comparação entre os níveis de mRNA e proteína de quatro amostras individuais de três cepas de vermes mostrou baixa variabilidade dos níveis de mRNA com maior variabilidade no nível da proteína.
No contexto do isolamento do DNA, o rendimento é altamente dependente da proficiência para recuperar a camada interfásica nublada da camada orgânica, ou rosa. Para melhorar a solubilização das proteínas da pelota aumentando o volume de tampão de resolutização ou adicionando outros detergentes além da SDS pode ser necessário. O uso deste método pode ajudar a identificar corretamente casos em que a tradução do mRNA para a proteína não é corelativa e pode levar a uma investigação mais profunda dos mecanismos regulatórios pós-transcricional e pós-translacional em várias condições.
Em nosso laboratório, este protocolo tem sido usado para conservar amostras valiosas e limitadas do núcleo de tempo. Além disso, posso imaginar que este seria um protocolo útil para adotar no campo do ritmo circadiano. O reagente GCTP e os solventes utilizados no isolamento do RNA são perigos e devem ser usados com cautela.
