Os autores gostariam de agradecer MICINN (PTA programa de apoio Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Phd Fellowship para Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programa de apoio Julián Cerón), e Marie Curie IRG, ISCIII e IDIBELL para financiamento o laboratório.

1. Protocolo A: Worms cultivo de Branqueamento 11 Grandes populações de C. elegans pode ser obtido através da cultura de los quer em meios líquidos ou em suportes sólidos em placas. Eles são geralmente cultivadas em NGM sólido (meios de crescimento dos nemátodos) e alimentados com E. bactérias coli, que é adicionado para as placas, ou vivos ou mortos (morto por UV 12, pelo calor 13 ou pelo frio 14). O procedimento mais comum usa ao vivo OP50 E. coli, que é defeituoso na síntese de uracilo e não pode overgrow em uma camada de espessura que obscurecer os vermes. <ol><li> Misturar 3 g de NaCl, 17 g de agar e 2,5 g de peptona e adicionar 975 ml de H2O Autoclavar para 50 min. </li><li> Arrefecer a 55 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol em etanol, 1 ml de 1 M MgSO4 e 25 ml de 1 M KPO 4 tampão (todos eles, mas colesterol anteriormente autoclaved). </li><li> Usando procedimentos estéreis dispensar a solução NGM em placas de Petri; encher placas até 2/3 do seu volume. </li><li> Depois de seco, é aconselhável para deixar placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para a detecção de contaminantes. Prepare uma seqüência de OP50 E. coli a partir de um stock de glicerol (OP50 pode ser obtido a partir do Genetics Caenorhabditis Center). </li><li> Escolher uma única colónia e crescer em LB durante a noite a 37 ° C com agitação. </li><li> Permitir que o excesso de humidade para evaporar a partir das placas, removendo a tampa no fluxo laminar e adicionar OP50 para o centro das placas com uma pipeta de Pasteur estéril. </li><li> Permitir que o E. OP50 relvado coli a crescer durante a noite à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Adicionar a quantidade desejada de vermes para as placas (se as placas incubadas a 37 ° C deve ser arrefecida à temperatura ambiente antes da utilização). </li></ol> DICAS: <ul><li> O derrame de a mesma quantidade de meios de comunicaçãoNas placas com uma pipeta ou um dispensador de bomba assegura o mesmo volume de agar para as placas e facilita o deslocamento da placa, sem necessidade de reorientar o estereomicroscópio. </li><li> Placas (ambos semeado e unseeded com bactérias) pode ser usado de várias semanas após preparado quando armazenado num recipiente à temperatura ambiente ou a 4 ° C. </li><li> Evitar plaqueamento das bactérias para a borda da placa. Se o relvado estende-se às bordas da placa de os vermes podem rastrear os lados, secar e morrem. </li><li> Worms viver mais tempo se as bactérias inoculadas sobre as placas já estão mortos 15. </li></ul> 2. Protocolo B: O tratamento com solução de hipoclorito Alcalina (&quot;branqueamento&quot;) 11 A técnica de branqueamento é utilizado para sincronizar C. culturas elegans, na primeira etapa larval (L1). O princípio do método reside no facto de que os vermes são sensíveis a lixívia enquanto a casca do ovo protege embryos a partir dele. Após o tratamento com solução de hipoclorito alcalino, os embriões são incubadas em meio líquido sem alimento, o que permite a eclosão, mas impede o desenvolvimento adicional. <ol><li> Permitir vermes a crescer até o estágio adulto. </li><li> Recuperar os adultos fêmeas grávidas em 15 tubos de ml por lavagem as placas com tampão M9. </li><li> Vermes pelotas por centrifugação durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm numa centrífuga de mesa padrão) à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. </li><li> Realizar lavagens 1-3 até que o buffer parece claro de bactérias. </li><li> Adicionar a solução desejada de branqueamento (Tabela I) e agitar durante alguns minutos (a destruição do tecido adulto deve ser monitorizada sob o microscópio de dissecação ea reacção parou quando vestígios de adultos ainda são visíveis, o que leva normalmente entre 3 e 9 minutos, dependendo vários questões, tais como o volume de sedimento verme, mencionado na discussão) (Fig. 3). </li><li> Pare de reacção adicionando M9 Buffer para encher o tubo. </li><li> Rapidamente centrifugar (uma vez que o tratamento pode ainda ser activa) durante 1 minuto a 400 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar pelota mais três vezes, enchendo o tubo com tampão M9. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão M9 ao sedimento, ou colocar os ovos para placas NGM unseeded, e incubar à temperatura desejada com agitação suave. Arejamento adequado deve ser fornecido (Fig. 4). </li></ol> DICAS: <ul><li> Existem diferentes soluções de branqueamento, escolher o que funciona melhor em suas mãos (Tabela 1, fig. 1). </li><li> Ovos já estabelecidas sobre as placas podem ser recuperados por escarificação da superfície do agar com um material macio tal como um pedaço de uma película de raios-X. </li><li> Restos demais de animais adultos podem prejudicar a sincronização, já que constituem uma fonte de alimento para as larvas recém-eclodida. </li><li> As temperaturas mais elevadas acelerar um pouco o desenvolvimento que é inconveniente if qualquer verme sincronização salta porque a diferença de desenvolvimento entre vermes sincronizadas e não sincronizadas será maior a temperaturas mais elevadas. </li><li> Solução de branqueamento deve ser realizada imediatamente antes da sua utilização. Além disso, lixívia perde potência depois de ter sido aberta por um tempo, em parte devido à sua fotossensibilidade. Sugerimos a alíquota de cada frasco novo em odres âmbar pequenas quantidades para evitar tais perdas e minimizar a exposição à luz. </li></ul> 3. Protocolo C: Chapeamento Worm <ol><li> Esperar entre 12 e 24 horas (o tempo para completar o desenvolvimento embrionário depende da temperatura) depois do branqueamento foi realizado e recuperar vermes por centrifugação (2 minutos a 400 xg). </li><li> Elimine o sobrenadante vermes, sementes sobre as placas necessárias e deixe o líquido restante seca. </li><li> Colocar as placas à temperatura requerida. </li></ol> DICAS: <ul><li> Larvas L1 em ​​tampão M9 pode ser mantido a 15 ° C agitando pelo menos durante uma semana wiThout alterações óbvias. </li><li> ter cuidado ao calcular os Worms vai semente porque muitos podem esgotar a comida mais rápido do que o esperado e arruinar a sua experiência. Cerca de 500 L1 pode atingir a idade adulta em uma placa de 55 milímetros, sem ficar sem comida. </li></ul> 4. Protocolo D: C. elegans observação D.1 Nomarski observação Microscopia de contraste de interferência diferencial é uma técnica de microscopia óptica de iluminação utilizada para melhorar o contraste em amostras não coradas transparentes. O Nomarski palavra refere-se ao prisma usado, o nome de seu inventor. Através da observação dos animais vivos, somos capazes de analisar a fisiologia do animal com as alterações apenas derivados de imobilização. Além disso, como não fixador é adicionado, marcadores fluorescentes podem ser observados in vivo. Este facto e à possibilidade de marcadores fluorescentes de fusão para um gene de interesse tornar possível a seguir os processos em which a proteína de estudo podem estar envolvidos. Ao utilizar a técnica descrita no este protocolo, não só vermes vivos pode ser observado, mas também podem ser recuperados e plaqueadas de novo. Preparação Agar pad (imediatamente antes da utilização): <ol><li> Preparar agarose 2% em água e derreter. Manter fundidos a 65 ° C. </li><li> Coloque duas lâminas com um pedaço de fita adesiva sobre eles em ambos os lados de uma corrediça, terceiro limpo. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur lugar uma gota de ágar sobre a superfície limpa. </li><li> Cobrir o agar com outra lâmina limpa colocada no topo das três lâminas perpendicularmente. </li><li> Pressione cuidadosamente para que o gota agar é achatado com a espessura dos espaçadores de fita. </li><li> Uma vez que o agar solidifica, puxe as lâminas gravadas e separar as duas lâminas restantes deslizando um em relação ao outro. </li></ol> Montagem de animais vivos <ol start="7"><li> Coloque uma gota (10 ul) de levamisole 1 mM ou azida de sódio 10-30 mM para tele centro do painel. </li><li> Transferência dos animais para a queda usando uma picareta worm. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela sobre os animais e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone. </li></ol> DICAS: <ul><li> Manter alíquotas de agarose a 2% a 4 ° C. </li><li> De agarose fundida pode ser mantido a 65 ° C durante pelo menos um dia. </li><li> Nota: Levamisole é um agonista do receptor nicotínico que provoca paralisia muscular espástica 16. </li><li> Seja cauteloso, Azida de sódio é extremamente tóxico! </li></ul> D.2 fixação e coloração Etanol DAPI O protocolo descrito aqui representa uma maneira rápida de tingimento vermes com DAPI, no entanto, devido à dissecação do worm algumas estruturas podem apresentar alguma alteração. Existem vários outros métodos para corrigir vermes anteriores para a coloração DAPI, tais como fixação com solução de Carnoy ou formaldeído que preservam a integridade melhor do verme 17. Fixação etanol (modificado a partir do 18) <ol><li> O local de ~ 10 ul de tampão M9 (ou água) numa lâmina de microscópio. </li><li> Usando um verme Escolha com cuidado transferir 10-25 vermes para a queda. </li><li> Utilizando papel de filtro ou um micro-pipeta remover tanto quanto tampão M9 quanto possível sem a remoção dos vermes ou deixá-los seco. </li><li> Adicionar ~ ul 10 de etanol 90% e deixe secar. </li><li> Repita o passo 4, uma ou duas vezes. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol coloração (DAPI) <ol start="6"><li> Misturar DAPI com os meios de montagem desejada para uma concentração final de 2 ng / uL. </li><li> Uma vez que o etanol se ter evaporado completamente, adicionar 7 uL da DAPI: mistura meios de montagem. </li><li> Coloque uma lamela e corrigi-lo em ambos os lados com um pouco de unha polonês ou silicone. As lâminas estará pronto para ser min observação aproximadamente 5 após a adição de DAPI. </li></ol> DICAS: <ul><li> A montagem media contém glicerol, portanto, uma pequena quantidade é suficiente para cobrir toda a preparação. </li><li> Existe uma grande variedade de comerciais meios de montagem (Fluoromount ou prolongar, por exemplo), a sua qualidade e preço dependem de quanto tempo você deseja armazenar sua amostra. </li><li> Tenha cuidado, DAPI é um mutagênico conhecido que liga fortemente a AT regiões ricas em DNA. </li></ul> Receitas Médio nematóide do Crescimento (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM de NaCl 0,25% (w / v) de peptona 1 mM de CaCl2 5 ug / ml Colesterol 25 mM KPO 4 1 mM de MgSO4 Tampão M9 KH 2 PO 4 22mm 42 mM de Na 2 HPO 4 86 mM de NaCl 1 mM de MgSO4 Soluções de branqueamento testado <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> receita # 1 </td><td> receita # 2 </td><td> receita # 3 </td><td> receita # 4 </td><td> receita # 5 </td></tr><tr><td> água (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> de hidróxido de sódio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> hipoclorito de sódio ~~~V 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> total (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabela I. Diferentes receitas de soluções de branqueamento testado para este artigo. Receitas # 3 e # 4 são 2x, e deve ser adicionado ao mesmo volume de M9. Receitas para # 1, # 2 e # 5 tenham sido previamente relatado 2, 11, 19. As concentrações finais: # 1 de NaOH 0,25 M, NaOCl ~~~V 0,8%<html> , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Os resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Comparação de cinco diferentes soluções de branqueamento em duas diferentes tempos de incubação. Vermes N2 lavada duas vezes com M9 foram divididos em cinco 15 ml tubos cónicos contendo cada solução de branqueamento. Os tubos foram agitados vigorosamente e 1 ml transferida para um tubo novo com M9 para parar a reacção após o tempo especificado. Após o branqueamento vermes procedimento foram incubadas com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Em cada caso, inferior fotografia foi tirada apenas depois do branqueamento, quadro superior 24 horas mais tarde. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura da solução de branqueamento afecta a eficácia do tratamento. Volumes iguais de vermes N2 foram branqueadas com a mesma solução de branqueamento quer previamente arrefecida em gelo durante 20 minutos ou mantidas a 25 ° C durante o mesmo tempo. As duas colunas sobre as imagens da apresentação de esquerda apenas após o clareamento. Depois de vermes de tratamento foram incubadas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Colunas sobre as imagens de exibição direito 24 horas depois. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. A razão de verme pelete: tempo de incubação de hipoclorito alcalino afecta a eficácia do tratamento 50, 100, 250 e 500 uL de verme pelete foram incubadas com 2 ml de solução de branqueamento # 3 para 3 minutos, 6 e 9.. Eclodidos L1, embriões mortos e restos de fragmentos adultos foram quantificados após incubação a 20 ° C durante 2<html> 4 horas em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de tampão M9. Cerca de três placas confluentes 55 mm com vermes adultos são necessários para obter uma 100 l verme pelota. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Arejamento adequado é necessária para a incubação e sobrevivência de C. elegans embriões. Uma pelota 100 uL de vermes N2 foram branqueadas durante 6 minutos e incubou-se em 15 ml tubos cónicos com 1 ml, 5 ou 10, conforme especificado, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. A parte superior da figura mostra imagens das culturas após 24 horas, onde as setas indicam os ovos que não chocam. Na parte inferior, existe um gráfico que descreve a quantidade de larvas (cinzento claro) e embriões mortos (cinzento escuro) 48 horas depois do branqueamento com as condições indicadas. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. uma. Comprimento aproximado dos vermes em diferentes fases. Horas necessário para atingir cada fase, dependendo da temperatura (modificado a partir de 20). B. Nomarski (para cima) e DAPI (para baixo) imagens de vermes diferentes nas fases de desenvolvimento indicados. Características mais significativas em cada fase são ampliados L1: seta indica os precursores do desenvolvimento das gónadas somática e da linha germinal precoce L4: seta preta (Nomarski) indica a vulva desenvolvimento; setas brancas (DAPI) indicam os dois braços gonadais Mid-... tarde L4: seta indica a vulva desenvolvimento na fase árvore chamada Natal jovens adultos:. seta preta indica um embrião dentro do útero, seta aponta para a espermateca, seta branca indica um oócito Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) aponta embriões fertilizados. Seta em DAPI imagem indica espermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="A Figura 6" /> Figura 6. Morfologia vulva em L3, L4 e estádios adultos. Na fase L3 apenas lúmen uma pequena onde a vulva é formada pode ser observado. Na L4, essa luz se expande formando o chamado &quot;árvore de Natal&quot;. No adulto a vulva já está fechado. As linhas amarelas indicar a localização da vulva a estes três fases. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="A Figura 7" /> Figura 7. Coloração DAPI em L3, L4 cedo, estágios L4 e Adultos. Na L3, germinal é alongado. Em L4, gônadas braços morfologia U-presente. Na tarde-L4 esperma estágio pode ser observado na parte distal das gônadas. Adultos jovens apresentam oócitos. A linha germinal adulta apresenta oócitos e embriões. As linhas amarelas delimitam linhas germinativas em theletrônicos diferentes estágios definidos. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="A Figura 8" /> Figura 8. C. elegans desenvolvimento aos 15 e 25 ° C. vermes N2 foram branqueadas, incubadas durante a noite em M9 e agitação a 15 ° C, transferidos para placas e cultivadas nos tempos indicados nas temperaturas indicadas.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The nematode Caenorhabditis elegans. , (1988).</li><li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+and+cell+death:+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research.">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li><li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans.">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li><li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li><li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+longevity:+lessons+from+C.+elegans.">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li><li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans.">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans.">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49 (2008).</li><li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance.">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li><li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington's+disease+using+Caenorhabditis+elegans.">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504 (2007).</li><li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle.">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition.">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li><li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Sincronização de nematóide Várias soluções de branqueamento têm sido descritos. Tentámos cinco receitas diferentes (Tabela I) e, nas nossas mãos, eles não mostraram diferenças significativas na sincronização de populações de vermes (Fig. 1). No entanto, as nossas experiências fez mostram que os parâmetros como a temperatura (Fig. 2), a solução rácio de branqueamento: volume de vermes (Fig. 3) e do volume de ...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

A investigação sobre a biologia molecular e do desenvolvimento de Caenorhabditis elegans nematóides foi iniciada na década de setenta por Sydney Brenner e desde então tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo 1. C. elegans possui atributos-chave, tais como a transparência, simplicidade e ciclo de vida curto que o tornaram um sistema experimental para estudos biológicos fundamentais para vários anos 2. Descobertas neste nematóide tem amplas implicações, pois muitos processos celulares e moleculares que o desenvolvimento animal controle evolutivo são 3 conservada. C. elegans ciclo de vida passa por uma fase embrionária e quatro estágios larvais antes de os animais atingirem a idade adulta. Desenvolvimento pode levar de 2 a 4 dias, dependendo da temperatura. Em cada uma das várias fases traços característicos podem ser observadas. O conhecimento da sua linhagem celular completa 4,5, juntamente com o annotat profundaíon de seu genoma transformar este nematóide em um grande modelo em domínios tão diversos como a neurobiologia, 6 de envelhecimento 7,8, biologia das células estaminais 9 e biologia germinal 10. Uma característica adicional que faz com que C. elegans um modelo atraente para trabalhar com a possibilidade de obtenção de populações de vermes sincronizados a uma fase específica através de um protocolo relativamente fácil. A facilidade de manutenção e propagação deste nemátodo adicionado à possibilidade de sincronização proporcionar uma ferramenta poderosa para obter grandes quantidades de vermes, que podem ser utilizados para uma grande variedade de pequenas experiências ou de alto rendimento como telas de RNAi, microarrays, sequenciação maciço, immunoblot ou hibridação in situ, entre outros. Devido à sua transparência, C. elegans estruturas podem ser distinguidos sob o microscópio usando microscopia de contraste de interferência diferencial, também conhecido como Nomarski microscopiar. A utilização de um ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol), por exemplo, pode levar à identificação e localização específica de células individuais, bem como as estruturas subcelulares / defeitos associados aos mesmos.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo<em&gt; C. elegans</em&gt; Torná-lo um organismo modelo agradável para trabalhar. A possibilidade de vermes sincronização permite que o trabalho com uma quantidade significativa de sujeitos na mesma fase de desenvolvimento, o que facilita o estudo de um processo particular em muitos animais.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

45.9K visualizações.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. A facilidade de manutenção e propagação do nemátodo C. elegans Torná-lo um organismo modelo agradável para trabalhar. A possibilidade de vermes sincronização permite que o trabalho com uma quantidade significativa de sujeitos na mesma fase de desenvolvimento, o que facilita o estudo de um processo particular em muitos animais.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologia

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Avaliação das taxas de síntese de proteínas de novo em Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...