Agradecemos a Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson de pioneiro dessa técnica. Agradecemos a Pavan Kadandale e Brian Geldziler para vídeos mostrando espermatozóides ativados; membros do laboratório Singson para discussões úteis; CGC para as estirpes e NIH para apoiar-nos através de subvenção (R01HD054681).

1) O enriquecimento da população masculina <ol><li> Dependendo da necessidade experimental, um grande número de homens pode ser obtida através do emprego de uma das seguintes estratégias: <ol><li> grande população de machos do tipo selvagem pode ser obtida através do cruzamento 5 machos tipo selvagem e um hermafrodita em um gramado pequeno de OP50 semeado no centro da placa NGM. Cerca de 50% da geração seguinte será do sexo masculino do tipo selvagem. </li><li> ele-5 (e1490) ou ele-8 (e1489) hermafroditas jogar grande número de machos.-lo-5-8 e ele os machos são férteis e não há nenhum defeito óbvio na morfologia espermática e função. Então, ele-5 ou ele-8 do sexo masculino pode ser usado no lugar de homens do tipo selvagem de muitos experimentos. </li></ol></li></ol> 2) Identificação e isolamento dos machos <ol><li> Examinar a morfologia da cauda de vermes; cauda do verme macho é arredondada. </li><li> Escolha L4 machos palco e transferi-los para uma placa NGM semeado com E. coli OP50 e deixá-los crescer para um dia ou dois. Crescente homens celibatários na ausência de hermafroditas evitar a perda de esperma e, assim, grande número de espermátides estaria disponível durante o procedimento experimental. </li><li> No dia da dissecção, a transferência dos machos celibatários em uma placa NGM sem bactérias e deixá-los rastejar por alguns minutos. Este passo ajuda a remover pequena camada de E. coli aderidas na superfície de worms. Alternativamente, pipeta pequeno volume de tampão M9 (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g de NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O por litro) em um vidro de relógio e os machos de transferência para a reserva. </li></ol> 3) Dissecção do sexo masculino e na ativação in vitro <ol><li> Dê uma lâmina de vidro e marcar um pequeno círculo com uma caneta pap. Pipeta 30-50 mL de esperma Médio 1X (50 mM HEPES, 25mM KCl, 45mm NaCl, 1mM MgSO 4, CaCl 5mM 2, 10mM Dextrose; pH 7.8) dentro do círculo. O círculo hidrofóbico ajuda a manter a média de esperma dentro de sua fronteira. </li><li> Transferir os machos 50-10 para o meio do esperma. </li><li> Visualizando o slide ao microscópio, segure duas seringas anexado com 27 agulhas em ambas as mãos. </li><li> Use uma agulha para &#39;hold&#39; do verme e use a outra agulha para cortar a extremidade posterior dos machos para liberar espermátides. </li><li> Corte o worm normalmente expele grande número de espermátides instantaneamente. O espermátides são visíveis como minuto grânulos &quot;sob o microscópio estéreo. No entanto, por vezes, parte ou a maioria das espermátides podem ser retidos dentro da carcaça. Nesse caso, gentilmente &#39;arrastar&#39; a carcaça sobre a lâmina de vidro podem facilitar a liberação de espermátides da carcaça. </li><li> Para ativar o espermátides, dissecar o worms no Médio Esperma 1X contendo E pronase (20μg/ml) e deixe-os descansar por 5 minutos. </li><li> Não permita que os slides para tornar-se seca em nenhum momento do experimento. Adicionar Médio Esperma mais 1X, se necessário. </li></ol> 4) Visualização de spermtids e espermatozóides <ol><li> Delicadamente, coloque uma lamela na superfície da amostra dissecados. </li><li> Encontrar o campo de espermátides em pequeno aumento (10x) </li><li> Detalhes de espermátides ou espermatozóides podem ser observadas movendo-se para maior ampliação - geralmente em imersão em óleo 100X. </li></ol> 5) Resultados Representante Um exemplo de imagem DIC de espermátides isolado de C. elegans macho é mostrado na Figura 1. Espermátides são esféricas e os núcleos são proeminentes. In vitro de espermatozóides ativados são mostrados na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. DIC imagem de C. espermátides elegans. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. DIC de imagem in vitro ativada C. elegans espermatozóides.

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	<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+of+germline+stem+cells,+entry+into+meiosis,+and+the+Sperm/Oocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).</li><li>Lhernault, S. W., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li><li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+male+C.+elegans+anatomy.">Introduction to male C. elegans anatomy.</a> WormAtlas. , (2008).</li><li>Shakes, D., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+spermiogenesis+in+C.+elegans:+a+pharmacological+and+genetic+analysis.">Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis.</a> Dev Biol. 134, 189-200 (1989).</li><li>Nelson, G. A., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+fusion,+pseudopod+extension+and+amoeboid+motility+are+induced+in+nematode+spermatids+by+the+ionophore+monensin.">Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin.</a> Cell. 19, 457-464 (1980).</li><li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+cell+biology+of+spermatogenesis+in+the+nematode+C.+elegans.">The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).</li><li>Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+spe-38+gene+encodes+a+novel+four-pass+integral+membrane+protein+required+for+sperm+function+at+fertilization.">The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization.</a> Development. 132, 2795-2808 (2005).</li><li>Xu, X., Sternberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+sperm+TRP+protein+required+for+sperm-egg+interactions+during+fertilization.">A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization.</a> Cell. 114, 285-297 (2003).</li><li>Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+spermatozoan+locomotion:+amoeboid+movement+with+almost+no+actin.">Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin.</a> J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).</li><li>Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chloride+channel+localizes+to+Caenorhabditis+elegans+spermatids+and+chloride+channel+blockers+induce+spermatid+differentiation.">A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation.</a> Dev Biol. 176, 1-16 (1996).</li><li>LaMunyon, C., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+viability+of+mutant+and+manipulated+sperm+by+artificial+insemination+of+Caenorhabditis+elegans.">Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 689-692 (1994).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Além de analisar os mutantes Spe, este protocolo tem outras aplicações importantes, tais como analisar a morfologia espermática com o envelhecimento. Espermátides e espermatozóides isolados usando este protocolo pode ser usado em outras experiências, como a jusante, imunocoloração do tipo selvagem e mutante de esperma 8, 9, motilidade do esperma em lâminas de 10, medidas fisiológicas 9, 11, ou até mesmo a inseminação artificial 12.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tuberculin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309623</td>
<td>Syringe: 1 ml, needle: 27G X &frac12; in</td>
</tr>
<tr>
<td>Pap pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed</td>
<td>00-8888</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>16004-406</td>
<td>Dimension: 75X25X1mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>48366045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6911</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and in vitro activation of caenorhabditis elegans sperm

Machos e hermafroditas são as duas formas encontradas naturalmente sexual na nemátodo C. elegans. Os espermatozóides amebóides são produzidos por machos e hermafroditas. Na fase anterior do gametogênese, as células germinativas dos hermafroditas diferenciar em número limitado de espermatozóides - cerca de 300 - e são armazenados em um &quot;saco&quot; pequena chamada espermateca. Mais tarde, os hermafroditas produzem continuamente oócitos 1. Em contraste, os homens produzem espermatozóides durante toda a sua exclusiva idade adulta. Os machos produzem espermatozóides tanto que representa&gt; 50% do total de células em um 2 adulto típico worm. Portanto, isolar os espermatozóides dos machos é mais fácil do que da de hermafroditas. Apenas uma pequena proporção dos machos são naturalmente gerados devido à espontânea de não-disjunção do cromossomo X 3. Cruzamento com os machos hermafroditas ou mais convenientemente, a introdução de mutações a dar origem a Ele (alta incidência de machos) fenótipo são algumas das estratégias através das quais pode-se enriquecer a população masculina 3. Os machos podem ser facilmente distinguidos dos hermafroditas, observando os 4 morfologia da cauda. Cauda hermafrodita é apontado, ao passo que no sexo masculino é de cauda arredondada com estruturas de acasalamento. Corte a cauda libera grande número de espermátides armazenada dentro do trato reprodutivo masculino. Dissecção é realizada sob um microscópio estéreo com 27 agulhas. Desde espermátides não estão fisicamente conectados com quaisquer outras células, a pressão hidráulica expele o conteúdo interno do corpo masculino, incluindo espermátides 2. Os machos são diretamente dissecado em uma pequena gota de &#39;Medium esperma&#39;. Espermátides são sensíveis a alteração no pH. Assim, HEPES, um composto com boa capacidade de tamponamento é utilizada nos meios de comunicação de esperma. Glicose e outros sais presentes na mídia esperma ajudar a manter a pressão osmótica para manter a integridade dos espermatozóides. Pós-meiótica diferenciação de espermátides em espermatozóides é denominado espermiogênese ou ativação de esperma. Shakes 5, 6 e Nelson anteriormente mostrou que espermátides arredondadas podem ser induzidas a se diferenciarem em espermatozóides pela adição de compostos de ativar diversos, incluindo pronase E. Aqui demonstramos in vitro espermiogênese de C. espermátides elegans utilizando pronase E. Espermiogênese de sucesso é pré-requisito para a fertilidade e, portanto, os mutantes defeituosos em espermiogênese são estéreis. Até então vários mutantes foram mostrados para ser defeituoso, especificamente no processo de espermiogênese 7. Anormalidade encontrada durante a ativação in vitro de romance Spe (Espermatogênese defeituoso) mutantes iria nos ajudar a descobrir jogadores adicionais participar neste evento.

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho<em&gt; C. elegans</em&gt; É descrito aqui. Cortar a extremidade posterior de espermátides macho libera. O espermátides pode ser ativado por adição de protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

16.2K visualizações.  Rutgers University. Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho C. elegans É descrito aqui. Cortar a extremidade posterior de espermátides macho libera. O espermátides pode ser ativado por adição de protease.