Agradecemos aos Metabolomics alvo UAB e Laboratório de Proteômica, que foi apoiado em parte pela pele Disease Research Center UAB (P30 AR050948 a C. Elmets), a O&#39;Brien Centro de lesão renal aguda UAB-UCSD (P30 DK079337 para A. Agarwal ) eo Lung Health Center UAB (HL114439 R01, R01 HL110950 para JE Blalock). Suporte para o espectrômetro de massa era de um NCRR Shared Instrumentação subvenção (S10 RR19261 para S. Barnes). Agradecemos também a Ray Moore para suporte técnico. C. cepas elegans foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH. Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01GM085105 ao MAM, incluindo um suplemento administrativa ARRA).

O protocolo como descrito abaixo está dividido em três secções: a cultura sem fim, extracção de prostaglandina, e análise de prostaglandina. Como observado, existem vários pontos quando as amostras podem ser armazenadas temporariamente a -80 ° C ou -20 ° C. 1. Worm Cultura Recomendamos cerca de 6 g de vermes estágio mistos para LC-MS/MS abrangentes. Isto deve proporcionar material suficiente para a detecção de pelo menos seis injecções separadas. Para a quantificação das PGs conhecidos por MRM numa única injecção ou dois, 1-2 g são suficientes. A análise dos extractos de culturas sincronizadas constituídos por um estágio específico também é possível. Até quatro diferentes linhagens podem ser cultivadas em simultâneo. Por exemplo, um tipo selvagem de controlo e três estirpes mutantes diferentes. <ol><li> Prepare 65 X-grandes (16 cm) placas NGM e bactérias concentrados para alimentação suplementar. Use NA22 bactérias para a semeadura. Para fazer com que as bactérias concentrados para alimentação suplementar, grow pelo menos quatro litros de NA22 em meio LB por 16-24 h. Girar, remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 100 ml de tampão M9. 200 a 400 ml desta solução bacteriana concentrada pode ser necessário para cada uma das estirpes de vermes. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Comece culturas vermes em 5 X-grandes placas. Cresça vermes durante aproximadamente 3 a 4 gerações até placas estão cheios de adultos grávidos. Concentrados bactérias devem ser adicionadas a placas para evitar a fome, conforme necessário (~ 1 ml / placa e deixar secar completamente, antes da tampa). </li><li> Lave hermafroditas grávidas off placas com tampão M9 e recolher os vermes em um tubo de polipropileno ml cônico de 50. </li><li> Permitir hermafroditas grávidas para liquidar o fundo (geralmente cerca de 3-5 min). Remover o sobrenadante, incluindo bactérias, ovos e vermes fase larval. Ressuspender em 15 ml de tampão M9 e misture delicadamente. </li><li> Transferir 200 ul da suspensão para cada verme de 60 placas NGM semeadas. Dispersar vermes entre as placas. Mantenha solução minhoca misturadoassim até que todas as placas foram semeadas para assegurar que eles recebem números aproximadamente iguais de vermes. </li><li> Complemente com bactérias concentradas, conforme necessário (~ 1 ml/plate/12 para período de 24 horas) para evitar a fome. Permitir placas secar ao ar antes de substituir pálpebras. Cresça vermes para 2-4 gerações, dependendo do número original de grainhas vermes, ou até as placas estão cheios de adultos grávidos. </li><li> Placas verme colheita uma cepa de cada vez. Lave os vermes fora as placas com tampão M9 e recolher, em 50 ml tubos de polipropileno (por exemplo, 6 tubos). Utilize uma solução tampão M9 para lavar um prato, em seguida, transferir o buffer cheio de verme para o próximo prato. Depois de lavar um número (por exemplo,. 10 º) de placas, transferir o buffer cheio de verme para o tubo de 50 ml. Encha o tubo até o topo com tampão M9. Repetir a lavagem para o resto das placas. </li><li> Como os adultos, grávidas para liquidar o fundo em 5-6 min, remover o sobrenadante (~ 35 ml) e consolidar em um ou dois tubos. Encher os tubos de 50 ml com fresh M9 buffer, deixe repousar por 3-5 min, e remover o sobrenadante deixando adultos grávidas. Repita 3 vezes ou até que o sobrenadante é transparente. </li><li> Utilizando um grande furo pipeta Pasteur, transferir tantos vermes quanto possível para dois tubos de polipropileno de 15 mL cónicos. Girar a 1000 RCF (~ 3500 rpm em CentraSL2) durante 5 minutos numa centrífuga clínica. Remover o sobrenadante e repetir até que todos os vermes são transferidas e sedimentadas no mesmo tubo. Remover tanto sobrenadante quanto possível, e armazenar vermes a -80 ° C. Repita o procedimento para todas as cepas. </li></ol> 2. Extração de prostaglandina Os reagentes necessários para a extracção são apresentados abaixo. O método que é modificada a partir da Golovko e Murphy 17 e inclui extracção com acetona seguido de purificação de líquido-líquido, o que aumenta a sensibilidade de LC-MS/MS. Uma bala homogeneizador misturador 5 é utilizado no processo, embora os resultados semelhantes podem ser obtidos com um homogeneizador de Dounce. Hydroxytolue Butylatedne (BHT) e evaporação sob atmosfera de azoto (N 2) de gás são utilizadas para evitar a oxidação. Todos os artigos de vidro devem ser siliconizado (Sigmacote) para reduzir a ligação de lípidos. A extracção com solventes orgânicos devem ser realizados numa câmara de química. <ol><li> Pesar um tubo cônico de 50 ml de polipropileno. Transferir aproximadamente 6,0 g de vermes congelados do tubo cónico de 15 ml armazenadas a -80 ° C por meio de corte do tubo com uma lâmina de barbear a quente perto da marca de 6,5 ml. Uma espátula de mistura de metanol e limpa pode ser usada para remover o verme sedimento congelado a partir do fundo do tubo. Ao cortar através do sedimento para recuperar a porção inferior, vermes larvais menos densas e bactérias residuais a partir do topo do sedimento são deixados para trás. </li><li> Transfira os vermes congelados até ao tubo de 50 ml pré-pesados. Se várias amostras estão sendo processadas, use a mesma quantidade (6,0 g) de tecido para estudos comparativos. Como o descongelamento vermes em uma pasta, adicionar ou remover vermes com a espátula para se obter a massa desejada. Opcional: add 1,00 ng de padrão PGF 2α-d4 como um controle interno para a eficiência da extração. </li><li> Adicionar 12 ml de gelado 02:01 acetona / solução salina com 0,005% BHT à suspensão verme e misturar bem em vórtice. Distribuir 1,5 ml da suspensão de minhoca a cada um dos doze 5 ml tubos de plástico auto-standing para uso no Blender bala. </li><li> Adicionar 0,7-0,8 ml de 0,5 mm de diâmetro Ceria esferas de óxido de zircónio estabilizado a cada tubo de 5 ml. Feche as tampas hermeticamente e carregar os 12 tubos na bala Blender 5 homogeneizador. Executar o misturador durante 3 minutos a velocidade de 8-9 e coloque os tubos em gelo. Certifique-se de fechar as tampas muito bem ou o conteúdo pode derramar. Entrada 10 ul de homogeneizado de um tubo numa lâmina através de um estereoscópio. Deve haver muito poucos intactos vermes restantes. Repita a mesma velocidade por mais um minuto, se for necessário. </li><li> Uniformemente transferir os homogeneizados para quatro tubos de vidro de 10 ml usando uma cónicas &quot;pipeta Pasteur 9. Evitar a transferência de grânulos. Lavar as pérolas a partir de três tubos Sequentially com 1 ml de 1:2 de acetona / solução salina contendo BHT. Repetir para outros tubos até que todas as esferas são lavadas. Transferir a solução restante (~ 4 ml) para tubos de vidro de 10 ml e os colocar em gelo. </li><li> Centrifugar os tubos de vidro de 10 ml, a 4 ° C numa centrífuga clínica a ~ 1000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante de cada tubo para um tubo cónico de 10 ml de vidro limpo. </li><li> Num capuz química, adicionar um volume igual de hexano a cada tubo de vidro de 10 ml. Por exemplo, adicionar 3,5 ml de hexano e 3,5 ml de acetona / solução salina. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos. </li><li> Centrifugar os tubos de vidro de 10 ml, a 4 ° C numa centrífuga clínica a ~ 1000 xg durante 10 min. Descartar a fase superior contendo hexano e lipídios carga neutra. </li><li> Acidifica-se a fase inferior a pH 3,5 com 2 M de ácido fórmico (cerca de 100 - 150 ul). Teste de pH utilizando tiras de pH. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio a cada tubo. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos e centrifugar os tubos à temperatura de 4 ° C icentrífuga clínica nd a ~ 1000 xg durante 10 min. </li><li> Remover e descartar a fase aquosa superior. Insira uma ponteira por meio de qualquer interfase leitoso residual para a fase de clorofórmio inferior, evitando a interfase. Recolher a fase inferior de cada um dos quatro tubos de 15 ml para um tubo de vidro cónico limpo. Incubar a -20 ° C durante pelo menos 24 horas. Neste ponto, o extracto pode ser armazenada a -20 ° C durante até duas semanas. </li><li> Leve o extrato do freezer e descartar a camada superior aquosa leitosa remanescente, se houver. Transferir a fase clorofórmio a um frasco de vidro de ½ Dram marcado revestido a teflon usando um novo pipeta de Pasteur. Num capuz química, evapora-se a fracção solúvel em clorofórmio até à secura sob uma corrente suave de N 2 de gás. O extracto seco pode ser armazenado a -20 ° C durante até 2 semanas. Um esquema geral utilizado para a extracção e análise de PG é mostrado na Figura 1. </li></ol> 3. Análise de prostaglandina <ol><li> Prepare estoqueAs soluções de referência individuais prostaglandinas, tais como PGF 2α ou PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) em metanol e dilui-se com metanol: água (8:2 v / v) para obter uma solução de trabalho. Prepara-se uma série de diluições (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) para gerar uma curva padrão. </li><li> Adicionar 200 uL de metanol: água (8:2 v / v) para a seco C. extrato lipídico elegans (s) e misture bem. Se menos do que 6 g de tecido sem-fim foi extraída, o extracto seco, deve ser ressuspenso em menos volume de metanol: solução aquosa. </li><li> Preparar a fase móvel consistindo de 0,1% de ácido fórmico em água de [A] e acetonitrilo contendo 0,1% de ácido fórmico, [B]. </li><li> Configure o autosampler a 4 ° C e coloque os frascos de amostra em um 70 de contagem de 1,5 ml cremalheira frasco. </li><li> Equilibrar a coluna de RP-C18 Sinergia hidro com 0,1% de ácido fórmico com um caudal de 0,2 ml / min durante cerca de 5 min. </li><li> Injectar a amostra (20-50 uL) na coluna. Realize gradiente início eluiçãoção com 10% de B e indo até 80% de B, 0-11 min, 80-100% de B, 11-14 min, e voltando a 10% de B em 16 min. O tempo total de execução é de 20 min. Os tempos de retenção dos padrões autênticos 13 são mostrados na Tabela 1 3 para referência. </li><li> Introduzir o efluente da coluna no espectrómetro de massa utilizando uma interface ESI operam no modo de ião negativo. O azoto é utilizado como nebulizador e gases cortina (CUR = 10). O gás de colisão, a energia de colisão, ea temperatura está fixada em 10, -35 eV e 600 ° C, respectivamente. Declustering potencial (DP), a energia de colisão (CE), e do potencial de saída da célula (CXP) são fixados em -90, -35 e -10, respectivamente. </li><li> Para varreduras (scans de pesquisa Q1), use o modo de íons negativos na faixa de massa de m / z 315-360 para a maioria das PGs (Figura 2). O intervalo pode ser alterado, dependendo da massa do composto (s) de interesse. Extrato de íons de corrente de íons totais (TIC) dos cromatogramas de íons LC-MS e determinar se a extraçãoiões ted correspondem aos iões ou desprotonados aduto, ou para iões fragmentados. </li><li> Para as experiências de MRM, transição de massa m / z 355/311 é utilizado para detectar a classe F1, m / z 353/193 é utilizada para a classe F2, e m / z 351/193 ou 351/191 é utilizada para a classe F3 (Figura 3). MRM também é usado para detectar o padrão interno (por exemplo, m / z 357/197 para PGF 2α-d4) e para gerar a curva padrão. Veja Murphy et al. Para mais informações sobre as transições de massa PG 18. </li><li> Para as experiências de MS / MS, usar m / z 355 para classe F1, m / z 353for classe F2, e m / z 351for PGs classe F3. C. elegans dados MS / MS para a série F PGs está disponível na Figura 4 e Tabela 2 3,16. Dados do MS / MS para eicosanoids mamíferos está disponível em <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Processar os dados analíticos utilizando Analyst software (versão 1.4.2, a Applied Biosystems). </li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Nós descrevemos um procedimento para extração e análise de eicosanóides, com foco em PGs F-series. Existem várias partes do procedimento que pode ser problemático. Em primeiro lugar, é essencial que as culturas sem-fim não ocupem, como a fome pode alterar o metabolismo de PG. Para uma alimentação suplementar, NA22 bactérias são recomendados em vez dos mais comumente usados ​​OP50 bactérias porque NA22 atinge maior densidade. No entanto, a estirpe NA22 carece de resistência aos antibióticos, e é mais susceptível de contaminação. Em segundo lugar, vermes sintetizar isômeros PG individuais em baixa abundância relativa de tecidos de mamíferos. Isto pode ser devido, em parte, à redundância entre os numerosos isómeros. Recomendamos cerca de 6 g de tecido para análise abrangente e sinais mais fortes. Menos de tecido (1-2 g), pode ser usado, se o extracto seco é ressuspenso em menos de metanol: solução de água para aumentar a concentração do PG. No entanto, apenas uma a duas injecções podem ser realizadas. O limite de detecção do nosso sistema LC-MS/MS é de cerca de 10 pgPGF 2α / ml. Um ml de densamente vermes estágio mistos (cerca de 1 g) produz cerca de 25-50 pg de CePGF2. Sistemas de espectrometria de massa mais sensíveis, pode reduzir a quantidade de tecido sem-fim utilizado para análise. Em terceiro lugar, as diferenças na eficiência de extracção PG entre as amostras podem causar resultados variáveis. Verificou-se que a eficiência da extracção é muito semelhante, quando os tecidos são extraídos em paralelo. Para determinar a eficiência, adicionar 1,0 ng de PGF 2α-d 4, no passo de homogeneização, como um controlo interno. Transição MRM utilizando massa m / z 357/197 é utilizado para medir a concentração de PGF 2α-d4 em relação a uma de 1 ng / ml de solução-padrão. É, então, calculado o valor de PGF 2α-d 4 perdida durante a extracção. Os parâmetros de cromatografia e transições de massa que podem ser alterados incluem detectar outras PGs e eicosanóides. Apesar de um esforço considerável, não temos sido capazes de identificar série D ou E-sers PGS nos extratos 17. Além disso, não ter detectado 8-iso PGF 2α e 8-iso PGE 2, que são característicos de livre peroxidação radical iniciado, o que gera uma mistura não selectiva de PG estereoisômeros 19. Se vermes sintetizar outros tipos de PG não é conhecido. Endocanabinóides e vários epoxi e hidroxilo metabolitos de araquidónico e ácidos eicosapentanóico foram encontradas em C. elegans extrai 5,7,20,21. Recomendamos o uso de ambos MRM e MS / MS em comparação com padrões autênticos para a quantificação e identificação, respectivamente. Para novos eicosanóides, estas análises deve ser combinada com um estudo comparativo dos mutantes de gordura, que são deficientes na síntese de AGPI de 22 enzimas, bem como um ensaio funcional, se possível. A ressalva a analisar os mutantes de gordura é que pequenas quantidades de ácidos graxos poliinsaturados presentes em vermes são suficientes para a síntese de PG. Por exemplo, as gorduras-2 (wa17) mutantestêm uma pequena quantidade de actividade de dessaturase D12 (~ 5% de tipo selvagem 22), e estes mutantes ainda produzem PGs 6. gordura-3 (WA22) e gordura-4 (WA14) mutantes não conseguem sintetizar PGs derivadas araquidónico e ácidos eicosapentanóico 16 . Descobrimos também que os mutantes de gordura para compensar a perda de aulas PUFA por up-regulação da síntese de PG restantes aulas. Por exemplo, a gordura-3 (WA22) mutantes não conseguem sintetizar a maioria das PGs derivadas de PUFAs 20 carbono. Em vez disso, eles parecem-regulam novos PGs derivadas de 18 carbonos PUFAs 16. Até o momento, não temos conhecimento de um C. elegans estirpe que é completamente deficiente na síntese de PG. É possível que PGs são essenciais para o crescimento ou desenvolvimento.

As prostaglandinas (PGs) são uma classe importante de hormonas de lípidos que têm sido amplamente investigados e envolvido na regulação da reprodução, imunidade, e desenvolvimento de uma ampla variedade de organismos de 12-14. PGs são idealmente adequados para análises de biologia de sistemas completos, porque eles compreendem uma série de lípidos derivadas de um precursor comum (s). O nemátodo C. elegans é um dos organismos modelo mais utilizados para tratar de questões fundamentais em genética e biologia de sistemas. Nós demonstramos que o C. elegans sintetiza PGs F-série que guia espermatozóides móveis para oócitos 3,6,16. As PGs F-series derivados de PUFA de 20 carbono com três, quatro e cinco ligações duplas, compreendendo o F1, F2, F3, e as classes, respectivamente, foram identificadas 3,16. Tais PGs são sintetizados independente das enzimas ciclo-oxigenase, ainda PGF estereoisómeros 2α 1α e PGF ainda são generated. Para as análises qualitativas e quantitativas de C. elegans PGs, LC-MS/MS é uma técnica analítica poderosa e sensível. Antes de realizar esta análise, é importante desenvolver um método de extracção optimizado porque o desempenho do processo analítico depende fortemente da qualidade do extracto. A cromatografia líquida e espectrometria de massa pode apenas fornecer a massa prevista para cobrar razão (m / z), bem como a forma de pico desejável, e o tempo de retenção do ião progenitor PG. Perfil metabólico de PGs em C. elegans é uma tarefa desafiadora que exige várias estratégias de aquisição de MS. LC-MS verificação completa ou pesquisa de varredura (Q1 scanning) tem a vantagem de garantir que os PGs mais ionizáveis ​​irá gerar uma resposta por espectrometria de massa. Enquanto a digitalização levantamento fornece informações úteis sobre o perfil do total de PGs no que diz respeito ao tipo selvagem e mutante C. elegans, a detecção de pequenos PGs está comprometida devido à baixa sensibilidade. Neverthemenos, LC-MS digitalização levantamento pode dar uma visão global das PGs e é particularmente útil para análise de mutantes preditos de afectar o metabolismo de uma grande população de PG. Na identificação de metabolito, a análise dos padrões de LC-MS/MS PG sintetizados quimicamente é realizada pela primeira vez obter os seus espectros de ião do produto como compostos de referência. Estes espectros pode ser comparado com o espectro de um metabolito desconhecido. Modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) é utilizado para maior sensibilidade e especificidade. Um experimento MRM é conseguido através da especificação do ião progenitor / produto de massa de iões de transição de um composto. Ao conhecer a massa e estrutura dos analitos alvo, é possível prever as transições MRM teóricos para diversos metabolitos desconhecidos. Um método LC-MS/MS optimizado para perfilar PGs isoméricos em C. elegans não foi avaliado. Aqui nós descrevemos uma abordagem integrada de extração e espectrometria de massa composta por LC-MS e LC-MS / MS métodos para detectar, quantificar e investigar C. elegans PG metabólitos. Esta abordagem pode ser aplicada a outros eicosanóides.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-large (16 cm) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875714</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain NA22</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>NA22</td>
			<td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, 399.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A928-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butylated Hydroxytoluene</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101162</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, 399%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC27048-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC26832-0010</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2&alpha;-d4</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>316010</td>
			<td>Cayman has a wide array of standards available for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile screw cap self-standing 5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-651</td>
			<td>For use with Bullet Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>ZrOB05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble Kimax</td>
			<td>45200-10</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml glass conical tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>8082-15</td>
			<td>Available through Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote (Siliconizing reagent)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V1235C-TFE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentraSL2 Clinical Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>2517N92-TS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender 5 blue homogenizer</td>
			<td>Next &gt;&gt;&gt; Advance</td>
			<td>BBY5MB</td>
			<td>A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &Aring; LC Column 250 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>00G-4375-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>AJ0-7510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td>
			<td>Phenomenenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler</td>
			<td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 4000 triple quadrupole mass spectrometer</td>
			<td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">M9 buffer recipe (4 liter)</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>12 g</td>
						<td>KH2PO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 g</td>
						<td>Na2HPO4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>20 g</td>
						<td>NaCl</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Up to 4 liter</td>
						<td>Deionized water</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool.</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>0.5 ml/bottle</td>
						<td>1 M MgSO4</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prostaglandin extraction and analysis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans está emergindo como um modelo animal poderoso para estudar a biologia de lipídios 1-9. As prostaglandinas são uma importante classe dos eicosanóides, os quais são sinais de lípidos derivados de ácidos gordos poliinsaturados (PUFAs) 10-14. Estas moléculas de sinalização são difíceis de estudar por causa de sua baixa abundância e natureza reativa. A principal característica das prostaglandinas é uma estrutura em anel ciclopentano localizado dentro da espinha dorsal do ácido gordo. Nos mamíferos, as prostaglandinas podem ser formados através da enzima ciclo-oxigenase-vias dependentes e independentes de 10,15. C. elegans sintetiza um vasto leque de prostaglandinas independentes de cyclooxygenases 6,16,17. A grande classe das prostaglandinas da série F foi identificado, mas o estudo de eicosanóides está em um estágio inicial, com amplo espaço para novas descobertas. Aqui nós descrevemos um método de extracção e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides. Lipídico cobrados são extraídas a partir de culturas de vermes em massa utilizando uma técnica de extracção líquido-líquido e analisadas por cromatografia líquida acoplada à tandem com ionização por electrospray, espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS). A inclusão de análogos deuterados de prostaglandinas, tais como PGF 2 α-d 4, como um padrão interno, é recomendado para a análise quantitativa. Monitorização de reacção múltipla ou MRM pode ser utilizado para quantificar e comparar os tipos específicos de prostaglandinas entre os animais do tipo selvagem e mutante. Decomposição induzida por colisão ou MS / MS pode ser utilizada para obter informação sobre as características estruturais importantes. Espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) varreduras de levantamento de uma gama de massa seleccionada, como por exemplo m / z 315-360 pode ser utilizado para avaliar as alterações globais nos níveis de prostaglandinas. Nós fornecemos exemplos de todas as três análises. Esses métodos irão fornecer aos pesquisadores um conjunto de ferramentas para a descoberta de novos eicosanóides e delinear suas vias metabólicas.

A preparação das amostras foi efectuada por extracção líquido-líquido, adaptado de Golovko e Murphy 17. Ele forneceu excelente recuperação do padrão interno (PGF 2α-d4). O regime geral para a extração de PG C. elegans é mostrado na Figura 1. Condições cromatográficas foram otimizadas para fornecer separação inicial&gt; 30 padrões de eicosanóides (Tabela 1 mostra 13 normas). Uma coluna de Hidro-RP (250 x 2,0 mm di) com água e acetonitrilo contendo 0,1% de ácido fórmico desde a melhor separação e sensibilidade. Verificações da pesquisa de extratos de mutantes do tipo selvagem e de gordura 3 mostrada na Figura 2 os níveis globais de documentos de iões dentro do intervalo de massas de 315-360 unidades de massa atómica. Gordo-3 (WA22) mutantes carecem de PUFA mais de 20 carbono. Uma classe de PG F3 é realçado. Na Figura 3, as análises de MRM de um extracto de tipo selvagem mostram vários isómeros de PG de F1 (Figura 3A </stro<html> ng&gt;), F2 (Figura 3B) e F3 (Figuras 3C e 3D) aulas. A classe F3 pode ser detectado com qualquer uma das duas transições de massa, m / z 351/193 ou m / z 351/191. CePGF2 é predominantemente constituída pelo PGF 2α enantiómero. CePGF1 passível PGF 1α ou o seu enantiómero. Figura 4 mostra a decomposição induzida por colisão de CePGF2 (RT = 11,8) comparada com o padrão α PGF2 (RT = 11,8). As pequenas diferenças de íons produtos são provavelmente devido a baixa abundância CePGF2 e compostos co-eluição no extrato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do C. elegans PGs extração e análise de LC-MS. Note-se que a acetona / solução salina e clorofórmio ambos têm 0,005% de BHT para minimizar a oxidação lipídica. Consulte o texto para mais detalhes.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver a figura maior. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Figura 2. Verificações da pesquisa de m / z 315-360 extractos de mutantes do tipo selvagem e de gordura-3 (WA22). Tempo de retenção de cromatograf ia líquida (RT) é mostrada no painel de [A]. Iões extraídos a RT = 11,3 são mostradas para o tipo selvagem [B] e gordura-3 (WA22) [C] extractos. Uma PG classe F3 com massa m / z 351 é realçado. Cps, contagens / seg; amu, unidade de massa atômica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Figora 3. MRM análises de extractos do tipo selvagem da classe F1. PGs são detectadas com a transição de massa m / z 355/311 [A]. Note-se que vários compostos hidrofóbicos (RT&gt; 14 min), que são susceptíveis de ser PGs, também são detectadas com esta transição. PGs classe F2 são detectadas com a transição de massa m / z 353/193 [B]. Classe F3 PGs são detectados com qualquer transição de massa m / z 351/193 [C] ou m / z 351/191 [D]. Note-se que os extratos contêm vários isômeros PG de cada classe. Os números correspondem aos agrupamentos mostrados na Tabela 2. A concentração de CePGF2 é de 1,8 ng / ml. TA, tempo de retenção; cps, contagens / seg. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Figura 4. Decomposição induzida por colisão de synth quimicamenteesized PGF 2α e CePGF2. setas no painel [A] indicam íons produtos ou fragmentação compartilhados entre PGF 2α e CePGF2 (RT = 11,8). Os iões dos produtos a m / z 309 e m / z 193 são gerados a partir de locais de clivagem indicados (realçado a e b), correspondem às estruturas mostradas, e são característicos da série F PGs [B]. Cps, contagens / seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Padrão </td><td> RT (min) </td><td> [MH] - m / z </td><td> Íons de produtos-chave em MS / MS </td></tr><tr><td> 20-hidroxi PGE2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> O tromboxano B 2 </td><td> 11,66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> B 4 Lipoxina </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxina A 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leucotrieno B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14 PGJ-2 </td><td> 16,80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os tempos de retenção e íons principais produtos de 13 normas eicosanóides do método LC-MS/MS 3. Mais de 30 padrões foram utilizados para desenvolver o programa de LC-MS/MS. Os tempos de retenção cromatográficos (RTs) diferem, mesmo entre os PGs muito semelhantes. Uma exceção é 2α 1α e PGF PGF. No entanto, estes são PGs distinguished pelas suas massas ião progenitor ([MH] - m / z) e induzida por colisão espectros de decomposição (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Classe das prostaglandinas </td><td> No. na Figura 3 </td><td> [MH] - m / z </td><td> Íons de produtos-chave em MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Íons de produtos de decomposição induzida por colisão de vários grandes C. elegans F1, F2 e F3 PGs mostrado na Figura 3. MS / MS de outros isómeros menos abundantes não são mostrados. Estes dados estão de análises múltiplas e nem todos os iões dos produtos pode ser visível num determinado prazo. Dada a complexidade dos extractos, alguns iões dos produtos menos abundantes podem derivar de um outro ião progenitor com o tempo de retenção similar ou resultam da interferência. Peak 2 é provavelmente um estereoisômero de CePGF1 e pico de 4 é provavelmente um estereoisômero de CePGF2. Veja Edmonds, et al. (2010) para dados adicionais 3.

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado para a extração e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides de<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizando LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

19.4K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado para a extração e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides de C. elegans Utilizando LC-MS/MS.

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biologia

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em três dimensões em Laboratório

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...