Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

Cette recherche a utilisé les ressources de l'Advanced Photon Source, un Bureau des utilisateurs scientifiques du département de l'Énergie des États-Unis (DOE) exploité pour le DoE Office of Science par Argonne National Laboratory en vertu du contrat no. DE-AC02-06CH11357. Ce projet a été soutenu par la subvention P41 GM103622 de l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health. L'utilisation du détecteur Pilatus 3 1M a été fournie par la subvention 1S10OD018090-01 de NIGMS. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne reflète pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national des sciences médicales générales ou des Instituts nationaux de la santé.

Tous les protocoles d'expérimentation animale ont été approuvés par l'Illinois Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol 2015-001, date d'approbation : 3 novembre 2015) et ont suivi le « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des NIH9 .
1. Préparation pré-expérimentale
<ol><li>Préparer 500 ml de la solution de Ringer (contient : 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4) fraîchement pour chaque jour de l'expérience.</li>
	<li>Remplir 200 ml de la solution de Ringer dans une bouteille de pulvérisation et conserver au réfrigérateur à 4 oC. Remplissez un plat Petri (10 cm de diamètre) avec la solution de Ringer et perfssez-vous avec 100% d'oxygène en connectant le tube d'un cylindre d'oxygène à une pierre d'air d'aquarium. Les plats Petri (« plats disséquants ») étaient préalablement recouverts d'un composé d'élastomère pour permettre l'insertion de goupilles pendant la dissection.</li>
	<li>Préparer les crochets de montage en métal. Couper deux morceaux de fil en acier inoxydable, de 0,5 mm de diamètre, à la longueur appropriée et plier le fil aux deux extrémités pour former des crochets. Disposez tous les outils de dissection, ciseaux, tontede de suture, micro-ciseaux à portée de main pour une utilisation. REMARQUE: La partie du crochet doit être d'environ 3 mm de long. Le fil plus long (se terminant dans un crochet) doit être d'environ 5 cm de long, et le fil plus court (se terminant également dans un crochet) doit être d'environ 1 cm de long afin d'adapter les chambres personnalisées utilisées à BioCAT et permettre une portée suffisante de mouvement pour le bras transducteur.</li>
	<li>
Connectez-vous et allumez tout l'équipement. Cela comprend un transducteur combiné moteur/force, un contrôleur de transducteur moteur/force, un stimulateur de courant biphasique de grande puissance et un système d'acquisition/contrôle de données contrôlé par ordinateur.
	<ol>
<li>Activez le système d'acquisition de données et étalonnez-le avant de commencer l'expérience10. En bref, étalonner la force en ajoutant un ensemble de poids connus, couvrant jusqu'à 50% de la force maximale mesurée par le transducteur de force dans une progression linéaire, sur le transducteur de force et l'enregistrement des changements de tension de sortie. Calibrer la longueur en appliquant un ensemble de tension de sortie connue sur le bras de levier et mesurer le changement de longueur du bras.</li>
		<li>Connectez les tuyaux du bloc thermique du support de l'échantillon à un bain circulant réfrigéré et fixez la température pour maintenir la température désirée dans la chambre entre 10 et 40 oC. Déterminez cela empiriquement à l'avance en réglant le bain circulant à une gamme de températures et en mesurant la température dans la chambre avec un thermocouple.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation musculaire
<ol><li>
Euthanasier la souris
	<ol>
<li>Euthanasier la souris par inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une luxation cervicale.</li>
		<li>Vaporiser la peau sur le membre postérieur avec la solution de Ringer froid pour empêcher les cheveux de souffler dans la préparation. Retirez la peau en la coupant autour de la cuisse à l'aide de ciseaux de dissection fine et tirez rapidement la peau vers le bas à l'aide de #5 forceps pour exposer les muscles.</li>
		<li>Amputer le membre postérieur et le transférer dans un plat disséquant qui a été rempli de la solution de Ringer oxygénée, puis placer sous un microscope à dissection binoculaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d'un muscle soleus
	<ol>
<li>Épingler le membre postérieur vers le bas dans le plat de dissection avec le muscle gastrocnemius tourné vers le haut. Couper le tendon distal du groupe musculaire gastrocnemius/soleus et soulever les muscles doucement et lentement en coupant le fascia de chaque côté du muscle gastrocnemius à l'aide de ciseaux fins. Isoler le groupe musculaire gastrocnemius/soleus du membre après avoir libéré le tendon proximal du muscle soleus.</li>
		<li>Épingler le groupe musculaire contenant le muscle gastrocnemius et le tendon distal vers le bas dans le plat de dissection. Soulevez doucement le muscle soleus par le tendon proximal et séparez-le du muscle gastrocnemius en laissant autant de tendon distal soleus intact que possible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d'un muscle extensor digitorium longus (EDL)
	<ol>
<li>Épinglez le membre postérieur vers le bas dans le plat disséquant avec le muscle antérieur de tibialis faisant face vers le haut. Couper le fascia le long du muscle antérieur de tibialis (TA) et le tirer clairement à l'aide de forceps. Identifiez et coupez le tendon distal du muscle de TA. Soulevez le muscle TA et coupez-le soigneusement sans tirer sur le muscle EDL.</li>
		<li>Coupez le côté latéral du genou et exposez les deux tendons. Couper le tendon proximal, en laissant autant de tendon que possible encore attaché au muscle, et soulever le muscle EDL (muscle médial) en tirant doucement le tendon. Couper le tendon distal une fois qu'il est exposé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage du muscle
	<ol>
<li>Épinglez le muscle par les tendons, et couper toute la graisse supplémentaire, le fascia et le tendon loin autant que possible. Insérez un tendon dans un noeud pré-lié et attachez la suture étroitement avec des forceps de liaison de suture. Attachez le deuxième noeud autour du crochet métallique.</li>
		<li>Répétez la même procédure avec le long crochet à l'autre extrémité du tendon. Assurez-vous qu'aucun des corps du muscle n'est contacté par les sutures. Cela endommagera la préparation.</li>
		<li>Fixez le crochet court au fond de la chambre expérimentale et le long crochet au transducteur/moteur à double mode. Bulle la solution dans la chambre expérimentale avec 100% d'oxygène.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimiser les protocoles de stimulation et la longueur musculaire
	<ol>
<li>Étirez le muscle en ajustant les micromanipulateurs attachés au transducteur/moteur pour générer une tension de base entre 15 et 20 mN avant de trouver les meilleurs paramètres de stimulus. Définir la tension de stimulation à 40 V. Le courant de stimulation est systématiquement augmenté jusqu'à ce qu'il n'y ait pas d'augmentation supplémentaire de la force de secousse. Le courant le plus élevé trouvé est augmenté d'environ 50% pour assurer l'activation supra-maximale.</li>
		<li>Trouver la longueur optimale, L0, défini comme la longueur musculaire qui donnent une force de secousse maximale, en augmentant la longueur musculaire et en activant le muscle avec une seule secousse jusqu'à ce que la force active (force de pointe moins la force de base) cesse d'augmenter.</li>
		<li>Effectuer une courte contraction tétanique (1 s activation) pour tester le montage et étirer le muscle à la force de base optimale si nécessaire. Enregistrez la longueur musculaire en mm avec un étrier numérique.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diffraction aux rayons X
REMARQUE: La description suivante concerne les expériences de diffraction des rayons X effectuées à l'aide de l'instrument de diffraction à rayons X à petit angle sur la ligne de faisceau BioCAT 18ID à l'Advanced Photon Source, Laboratoire national d'Argonne, mais des méthodes similaires pourraient être utilisées sur d'autres lignes de faisceau comme ID 02 à l'ESRF (France) et BL40XU à SPring8 (Japon). Beamline 18ID est actionné à une énergie fixe de faisceau x-ray de 12 keV (0.1033 nm longueur d'onde) avec un flux incident de 1013 photons par seconde dans le faisceau complet.
<ol><li>Choisissez un spécimen à la distance du détecteur (longueur de la caméra). Utilisez une longueur de caméra de 1,8 m pour des expériences examinant l'actine de 2,7 nm et des reflets de myosine de haut ordre tels que 2,8 nm réflexions méridionnelles. Utilisez un appareil photo de 4-6 m pour d'autres expériences, où l'on est principalement intéressé par les détails sur le méridien et les lignes de calque</li>
	<li>
Optimisation de la position de l'échantillon dans le faisceau
	<ol>
<li>Déterminer la position du faisceau à l'aide d'un morceau de papier sensible aux rayons X qui produit une tache sombre en réponse aux rayons X (« une brûlure »). Ensuite, utilisez un générateur de cheveux croisés vidéo pour créer un cross-hair aligné avec la marque de brûlure sur le papier ou tout simplement faire une marque sur l'écran vidéo avec un stylo marqueur.</li>
		<li>Utilisez l'interface utilisateur graphique fournie par BioCAT au positionneur de l'échantillon pour déplacer le muscle pour qu'il soit centré sur la position du faisceau. Osciller la chambre de l'échantillon à 10-20 mm/s en déplaçant l'étape de l'échantillon afin de répartir la dose de rayons X sur le muscle pendant l'exposition. Observez l'échantillon en se détachant pour éviter de grandes régions de fascia (contient du collagène qui polluera les motifs de diffraction) et pour s'assurer qu'il reste illuminé pendant tout le chemin de son voyage. REMARQUE: Les étapes exactes requises dans les sections 3.3 et 3.4 pour rendre les paramètres et les actions requis à l'aide de l'interface utilisateur graphique fournie par beamline seront spécifiques à la ligne de faisceau et au détecteur. Demandez au personnel de beamline comment effectuer ces opérations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuration du détecteur CCD (dispositif couplé charge) pour les modèles à haute résolution du muscle dans des états statiques définis (repos, ou pendant la contraction isométrique)
	<ol>
<li>Configurez le temps d'exposition et la période d'exposition dans l'interface utilisateur graphique du logiciel de contrôle. Prenez une image de fond sombre avant de prendre l'exposition et répéter cette procédure toutes les 2 heures ou après avoir changé de temps d'exposition pour corriger toute dérive dans l'électronique de lecture du détecteur.</li>
		<li>Atténuez le faisceau de rayons X à la valeur désirée pour l'exposition. Ensuite, prenez une image. Il n'est pas possible de prendre des séquences d'images avec ce détecteur. Le détecteur CCD a également besoin de plusieurs secondes pour lire une image individuelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuration du détecteur de tableau de pixels pour une expérience résolue dans le temps
	<ol>
<li>Configurez le nombre d'images, le temps d'exposition, la période d'exposition dans l'interface utilisateur graphique. Le détecteur de tableau de pixels utilisé ici a besoin d'au moins 1 ms pour être lu. La fréquence maximale de trame pour le détecteur de comptage de photons est de 500 Hz. Utilisez le signal de sortie du détecteur de comptage de photons pour contrôler l'obturateur de rayons X.</li>
		<li>Atténuez le faisceau à l'intensité désirée. Armez le détecteur et attendez la gâchette du système d'acquisition de données. Synchronisez les données mécaniques et les données radiographiques en les déclenchant en même temps. Les modèles de rayons X sont recueillis en continu tout au long du protocole a avec un temps d'exposition de 1 ms et une période d'exposition de 2 ms. REMARQUE: Le temps d'exposition exact et la période d'exposition doivent être déterminés au cas par cas pour l'information désirée et la durée de vie observée de l'échantillon dans le faisceau. Atténuer le faisceau afin d'utiliser pas plus de faisceau x-ray que ce qui est nécessaire pour fournir des données analysables dans la période d'exposition choisie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Traitement musculaire post-expérience
<ol><li>Récupérer et peser le muscle après chaque expérience mécanique et aux rayons X. Calculer la zone transversale du muscle en utilisant la longueur musculaire mesurée et la masse musculaire11 en supposant une densité musculaire de 1,06 g/mL12.</li>
	<li>Étirez le muscle à la longueur expérimentale et fixer le muscle en formaline de 10% pendant 10 min. Séparer le muscle fixe en une série de faisceaux de fibres sélectionnés à partir d'emplacements dans toute la section de croisement musculaire3.</li>
	<li>Mesurez la longueur des sarcomeres à l'aide d'un système de mesure de la longueur des sarques vidéo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Des publications récentes de notre groupe ont montré que les modèles de rayons X du muscle squelettique de souris peuvent être employés pour jeter la lumière sur l'information structurale sarcomeric du muscle dans la santé et la maladie1,2,3 particulièrement avec la disponibilité accrue de modèles génétiques modifiés de souris pour diverses myopathies. Les études mécaniques à haute résolution sur des fibres simples ou de petits faisceaux combinés à la diffraction des rayons X sont mieux faites par des experts. Si, cependant, des informations mécaniques plus modestes suffiront à vos fins, toute la préparation musculaire permet la collecte de modèles de rayons X détaillés à partir d'une simple préparation.
Une dissection propre est la clé d'une expérience mécanique combinée réussie et de rayon X. Il est très important de ne pas tirer sur le muscle cible ainsi que d'autres muscles associés aux muscles du soleus ou de l'EDL pendant la dissection, car cela pourrait déchirer des parties du muscle et conduire à une force réduite. Il peut également conduire à la structure interne endommagée qui dégradera les modèles de rayon X. Puisque tout se dispersera dans le faisceau de rayon X, il est important de nettoyer n'importe quelle graisse supplémentaire, le collagène dans le fascia aussi bien que tous les poils ou morceaux lâches de tissu tout en faisant le protocole suivant. Pour réduire la conformité supplémentaire dans la préparation musculaire, il est également important de lier solidement les tendons aux crochets, aussi près que possible du corps musculaire sans l'endommager.
Différents temps d'exposition aux rayons X peuvent fournir différents types d'informations à partir du même muscle. À l'aide du faisceau complet sur 18ID, un modèle équatorial analysable peut être obtenu dans une exposition de 1 ms (voir figure 2D). Pour une première réflexion de ligne de couche de myosine analysable, un temps d'exposition total de 10 ms est généralement nécessaire. Pour recueillir des réflexions méridionnels d'ordre plus élevé telles que le M15 (2,8 nm myosin emérique réflexion) et le 2,7 nm actin réflexion méridionnelle, généralement au moins 1 s exposition totale est nécessaire, mais plus de 2 s exposition totale est recommandée pour une grande précision Mesures.
Le choix du détecteur de rayons X optimal pour l'expérience est important. Pour les modèles de rayons X les plus détaillés, un détecteur CCD personnalisé, tel que celui de BioCAT avec environ 40 pixels de m et des fonctions de propagation de points de 65 m dans le phosphore, peut fournir des modèles avec une plage dynamique élevée et une bonne résolution spatiale, mais ne peut prendre qu'une image à la fois. Pour les expériences résolues par le temps, le détecteur de tableau de pixels de comptage de photons chez BioCAT peut collecter des modèles de rayons X à 500 Hz. La taille de 172 pixels avec ce détecteur, cependant, ne fournit pas une résolution spatiale suffisante pour des études détaillées de la partie intérieure du méridien, mais est adéquate pour la plupart des autres fins. BioCAT a fait l'acquisition d'un détecteur de comptage de photons haute résolution fournissant une résolution réelle de 75 millions de m à un taux d'images maximum de 9 000 Hz. On s'attend à ce que des détecteurs similaires de ce type supplantent les détecteurs actuels pour les études musculaires au cours des prochaines années.
Avec les flux très élevés de rayons X aux synchrotrons de troisième génération, les dommages causés par les radiations sont une grave préoccupation. C'est toujours un bon choix pour atténuer le faisceau pour ne pas fournir plus de faisceau que ce qui est nécessaire pour observer les caractéristiques de diffraction désirées. La même exposition totale aux rayons X peut être obtenue en prolongeant le temps d'exposition d'un faisceau atténué. Un avantage de comptage de photon s'appelle à ce que les images individuelles puissent être résumées sans pénalité de bruit. Même alors, des dommages de rayonnement sont possibles. Les signes de dommages de rayonnement incluent la baisse de la force maximale de contraction, le frottis des reflets de ligne de couche, même le changement de couleur de muscle.
Une des limites de la préparation intacte de muscle squelettique de souris est la difficulté en obtenant la longueur de sarcome du muscle intact pendant les expériences. Les muscles sont trop épais pour la microscopie vidéo et la diffraction laser. Tandis qu'avec des développements futurs il peut être possible d'estimer la longueur de sarcomere directement des modèles de diffraction14, à court terme la seule option est de la mesurer après l'expérience comme décrit ici.

La diffraction des rayons X à petit angle synchrotron est la méthode de choix pour étudier la structure à l'échelle nm des préparations musculaires qui contractent activement dans des conditions physiologiques. Fait important, l'information structurale provenant de préparations musculaires vivantes ou écorchées peut être obtenue en synchronie avec des données physiologiques, telles que la force musculaire et les changements de longueur. Il y a eu un intérêt croissant dans l'application de cette technique pour étudier la base structurale des maladies musculaires héritées qui ont leur base dans les mutations de point dans les protéines sarcomeric. La communauté de la biophysique musculaire a été très active dans la production de modèles de souris transgéniques pour ces maladies humaines qui pourraient fournir des bancs d'essai idéaux pour les études structurelles. Des publications récentes de notre groupe1,2,3 et d'autres4,5 ont indiqué que les modèles de rayons X de la souris extensor digitus longus (EDL) et les muscles soleus peuvent fournir tous les informations de diffraction disponibles à partir d'organismes modèles plus traditionnels tels que la grenouille et le lapin psoas muscle squelettique. Un avantage de la préparation de muscle squelettique de souris est la facilité de la dissection et d'effectuer la membrane-intacte de base, des expériences physiologiques entières de muscle. Les dimensions du muscle disséqué ont une masse suffisante pour produire des modèles musculaires très détaillés dans des temps d'exposition aux rayons X très courts (milliseconde par image) sur les faisceaux de rayons X de troisième génération.
Les modèles de diffraction de rayon X de muscle se composent des réflexions équatoriales, des réflexions meridional aussi bien que des réflexions de ligne de couche. Le rapport d'intensité équatoriale (rapport de l'intensité des réflexions équatoriales de 1,1 et 1,0, I11/I10), est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés, qui est proportionnel à la force générée dans le muscle squelettique de la souris 2. Les réflexions métrisales qui signalent des périodicités dans les filaments épais et minces peuvent être utilisées pour estimer l'extensibilité du filament1,3,6,7. Des caractéristiques de diffraction pas sur le méridien et l'équateur sont appelées lignes de couche qui résultent des têtes de myosine approximativement heliquement commandées sur la surface de l'épine dorsale épaisse de filament ainsi que les filaments minces environ helically ordonnés. L'intensité des lignes de couche de myosine est étroitement liée au degré de commande des têtes de myosine dans diverses conditions2,8. Toutes ces informations peuvent être utilisées étudier les comportements des protéines sarcomériques in situ dans la santé et la maladie.
La diffraction des rayons X synchrotron du muscle a été historiquement effectuée par des équipes d'experts hautement spécialisés, mais les progrès technologiques et la disponibilité de nouveaux outils de réduction des données indiquent que cela ne doit pas toujours être le cas. Le BioCAT Beamline 18ID à l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory dispose d'un personnel et d'installations de soutien dédiés pour effectuer des expériences de diffraction des rayons X musculaires qui peuvent aider les nouveaux arrivants sur le terrain à commencer à utiliser ces techniques. De nombreux utilisateurs choisissent de collaborer officiellement avec le personnel de BioCAT, mais un nombre croissant d'utilisateurs trouvent qu'ils peuvent faire les expériences et l'analyse eux-mêmes réduire le fardeau sur le personnel de beamline. L'objectif principal de ce document est de fournir une formation qui fournit aux expérimentateurs potentiels l'information dont ils ont besoin pour planifier et exécuter des expériences sur le système musculaire squelettique de la souris, soit à la ligne de faisceau BioCAT ou à d'autres lignes de faisceaux de flux élevés autour de la monde où ces expériences seraient possibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

Les modèles transgéniques de souris ont été des outils importants pour étudier la relation du génotype au phénotype pour les maladies humaines, y compris celles du muscle squelettique. Il a été démontré que le muscle squelettique de la souris produit des modèles de diffraction de rayons X de haute qualité sur les faisceaux synchrotron de troisième génération, ce qui donne l'occasion de lier les changements au niveau du génotype aux phénotypes fonctionnels en santé et en maladie en déterminant les conséquences structurelles des changements génétiques. Nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des spécimens, la collecte des modèles de rayons X et l'extraction des paramètres structurels pertinents à partir des modèles de rayons X qui peuvent aider à guider les expérimentateurs qui souhaitent effectuer de telles expériences pour eux-mêmes.

Contraction tétrique isométrique. Tout type d'expérience mécanique musculaire classique, comme les contractions isométriques ou isotoniques, peut être effectué avec l'acquisition simultanée de modèles de rayons X. Figure 1 A montre la configuration expérimentale pour les expériences mécaniques et radiographiques. Une trace de force d'exemple pour une contraction tetanique isométrique est montrée dans la figure 1B. Le muscle a été maintenu au repos pendant 0.5 s avant activé pendant 1 s. L'enregistrement mécanique s'arrête 1 s après le stimulus. Les modèles de rayon X ont été rassemblés sans interruption tout au long du protocole à 1 ms temps d'exposition à 500 Hz.
Modèles de diffraction de rayon X. Le modèle de diffraction de rayon X de muscle peut donner l'information structurale de résolution de nanomètre des structures à l'intérieur du sarcore. Les modèles de diffraction des rayons X musculaires sont composés de quatre quadrants équivalents divisés par l'équateur et le méridien. Le modèle équatorial provient de l'emballage myofilament dans le sarcome perpendiculaire à l'axe de fibre, tandis que les modèles méridional s'édulvent des informations structurales des myofilaments le long de l'axe de muscle. Les réflexions restantes non sur l'équateur ou le méridien sont appelées lignes de couche. Les lignes de calque (p. ex., les caractéristiques étiquetées MLL4 et ALL6 à la figure 2A) découlent de l'arrangement approximativement hélicoïl des sous-unités moléculaires à l'intérieur de la myosine contenant des filaments épais et de l'actine contenant des filaments minces. Les lignes de couche à base de myosine sont fortes et nettes dans les modèles du muscle au repos (Figure 2A), tandis que les lignes de couche à base d'actine sont plus importantes dans les modèles de muscle contractant (Figure 2B). Les modèles de différence obtenus en soustrayant le modèle de repos du modèle de contraction (figure 2C) peuvent faire la lumière sur les changements structurels pendant le développement de la force dans les muscles sains et malades. En suivant ces changements structurels à l'échelle temporelle milliseconde des événements moléculaires pendant la contraction musculaire, les modèles de diffraction des rayons X peuvent révéler des informations structurelles substantielles (figure2D).
Analyse de données à l'aide de MuscleX. Voici un exemple d'analyse des réflexions équatoriales à l'aide de la routine « équateur » dans le paquet MuscleX (figure 3). MuscleX est un logiciel d'analyse open-source développé chez BioCAT13. Le rapport d'intensité équatoriale (I1,1/I1,0) est un indicateur de la proximité de la myosine à l'actine dans le muscle au repos (Figure 3A), alors qu'il est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés dans la passation de marchés ( Figure 3B) muscle squelettique murine2. Le rapport d'intensité, I1,1/I1,0, est d'environ 0,47 dans le muscle au repos et d'environ 1,2 dans le muscle contractant. La distance entre les deux 1,0 réflexion (2-S1,0) est inversement liée à l'espacement inter-filament. Des documents détaillés et des manuels pour MuscleX sont disponibles en ligne13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figure 1 : Configuration et protocole d'expérience mécanique et de rayons X. (A) Le muscle est monté à une extrémité d'un crochet à l'intérieur de la chambre expérimentale et l'autre extrémité à un moteur à double mode / transducteur de force. Il se tient entre deux fenêtres de film Kapton pour permettre aux rayons X de passer à travers. La chambre est remplie de la solution de Ringer perfused avec 100% d'oxygène tout au long de l'expérience. (B) Le protocole mécanique pour les expériences de rayons X sur un muscle pendant la contraction tetanique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figure 2 : modèles de diffraction des rayons X EDL. EDL muscle X-ray diffraction modèle de repos (A) et la contraction (B) muscle. (C) Le modèle de différence entre le repos et le modèle de contraction. La région bleue indique une intensité élevée dans le modèle de repos, tandis que la région jaune représente une intensité élevée dans le modèle de contraction. (D) Modèle de diffraction de rayon X d'une exposition de 1 ms avec le muscle d'EDL. MLL1 - Ligne de couche de myosine de premier ordre; MLL4 - Ligne de couche de myosine de quatrième ordre; ALL1 - Ligne de couche d'actine de premier ordre ALL6 - Sixième ligne de couche d'actine d'ordre ; ALL7 - Ligne de couche actine septième ordre ; Réflexion de tm et de tropomyosine (indiquée par une boîte blanche); M3 - réflexion médique de troisième ordre; M6 - sixième ordre réflexion méridionnelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse des données des modèles équatorials à l'aide de MuscleX. L'arrière-plan soustrait le profil du rapport d'intensité équatoriale (alors que la zone) et les cinq premières commandes (lignes vertes) étaient aptes à calculer l'intensité de chaque pic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Diffraction de rayon X du muscle squelettique intact de Murine comme outil pour étudier la base structurale de la maladie de muscle

Nous présentons des protocoles détaillés pour effectuer des expériences de diffraction de rayon X de petit angle utilisant les muscles squelettiques intacts de souris. Avec la grande disponibilité de modèles de souris transgéniques pour les maladies humaines, cette plate-forme expérimentale peut former un banc d'essai utile pour élucider la base structurelle des maladies musculaires génétiques

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Physiologiquement intact muscle squelettique de la souris peut produire des modèles de diffraction des rayons X de haute qualité contenant beaucoup d’informations structurelles qui peuvent fournir un aperçu des processus physiologiques. La diffraction aux rayons X est la seule technique qui permet l’acquisition d’informations structurelles à haute résolution à partir de tissus musculaires vivants dans des conditions physiologiques réelles en temps physiologique réel. De nombreuses maladies musculaires sont héréditaires.Avec une disponibilité accrue pour modifier génétiquement la plupart des modèles de myopathies, la diffraction aux rayons X peut fournir des aperçus structurels des mécanismes de la maladie et indiquer des stratégies thérapeutiques. La plupart des muscles extenseurs digitorum longus et soleus sont particulièrement pratiques à cet effet. Mais beaucoup d’autres muscles chez les petits animaux peuvent être disséqués intacts et manipulés de la même manière.Avant de commencer la procédure, allumez le transducteur combiné de force motrice, le contrôleur transducteur de force motrice avec un stimulateur de courant biphasique de haute puissance, et un système de contrôle informatique de commande de données d’acquisition de données. Ensuite, vaporisez la peau sur le membre postérieur de la souris avec la solution froide de Ringer et utilisez des ciseaux de dissection fine pour couper la peau autour de la cuisse. À l’aide des forceps numéro cinq, tirez rapidement la peau vers le bas pour exposer les muscles et amputer le membre postérieur.Placez le membre dans un plat disséquant recouvert d’élastomères contenant la solution oxygénée de Ringer et placez le plat sous un microscope à disséquer des jumelles. Pour récolter le muscle soleus, épinglez le membre postérieur avec le muscle gastrocnemius orienté vers le haut. Utilisez des ciseaux fins pour couper le tendon distal du groupe musculaire gastrocnemius/soleus.Coupez le fascia de chaque côté du muscle gastrocnemius pour permettre aux muscles d’être soulevés doucement et lentement loin de l’os. Puis libérez le tendon proximal du muscle soleus. Épinglez le groupe musculaire contenant le muscle gastrocnemius et le tendon distal dans le plat.Soulevez doucement le muscle soleus via le tendon proximal pour le séparer du muscle gastrocnemius, laissant autant de tendon distal soleus intact que possible. Pour récolter le digitorum longus extenseur ou le muscle EDL, épinglez le membre postérieur dans le plat avec le muscle antérieur tibialis orienté vers le haut et coupez le fascia le long du muscle antérieur tibialis. Utilisez des forceps pour tirer le fascia clair et couper le tendon distal du muscle antérieur tibialis.Soulevez le muscle antérieur tibialis et coupez-le soigneusement sans tirer sur le muscle EDL, et coupez le côté latéral du genou pour exposer les deux tendons. Coupez le tendon proximal, nous laissant une grande partie du tendon que possible encore attaché au muscle et tirez doucement sur le tendon pour soulever le muscle EDL. Ensuite, coupez le tendon distal une fois qu’il est exposé.Pour monter le muscle récolté, épinglez le muscle par l’intermédiaire des tendons et coupez autant de graisse supplémentaire, fascia et tendon que possible. Insérez un tendon dans un nœud pré-attaché et utilisez des forceps de suture pour attacher la suture étroitement. Attachez le deuxième nœud autour du crochet métallique et répétez la procédure à l’autre extrémité du tendon.Attachez ensuite le crochet court au fond de la chambre expérimentale, et le long crochet au moteur transducteur à double mode. Bulle de la solution dans la chambre expérimentale avec 100% d’oxygène. Pour optimiser le protocole de stimulation et la longueur musculaire ajuster les micro manipulateurs attachés au moteur transducteur pour générer une tension de base entre 15 à 20 millinewtons pour trouver les meilleurs paramètres de stimulus pour étirer le muscle.Réglez la tension de stimulation à 40 volts. Le courant de stimulation sera systématiquement augmenté jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la force de contraction. Pour trouver la longueur optimale, augmenter la longueur musculaire et activer le muscle avec une seule secousse jusqu’à ce que la force active cesse d’augmenter.Effectuez une contraction tétanos d’une seconde pour tester le montage et étirer le muscle jusqu’à la force de base optimale au besoin. Enregistrez ensuite la longueur musculaire en millimètres avec un étrier numérique. Pour déterminer la position du faisceau, utilisez un morceau de papier sensible aux rayons X qui produit une tache sombre en réponse aux rayons X et un générateur de réticule vidéo pour créer un réticule aligné avec la marque de brûlure sur le papier.À l’aide de l’interface utilisateur graphique fournie par BioCAT au positionneur de l’échantillon, centrez le muscle sur la position du faisceau et déplacez l’étape de l’échantillon pour osciller la chambre de l’échantillon à 10 à 20 millimètres par seconde pour répartir la dose de rayons X sur tout le muscle pendant l’exposition. Observez l’échantillon pendant qu’il se déplace pour éviter les grandes régions de fascia qui contiennent du collagène et pour s’assurer qu’il reste illuminé pendant tout le chemin de son voyage. Armez le détecteur et attendez la gâchette du système d’acquisition de données.Déclenchez ensuite les données mécaniques et radiographiques en même temps pour les synchroniser. Les modèles de rayons X seront recueillis en continu tout au long du protocole avec un temps d’exposition de 10 millisecondes et une période d’exposition de 50 millisecondes. Dans cette contraction tétanique isométrique représentative, le muscle EDL a été maintenu au repos pendant 0,5 seconde avant d’être activé pendant une seconde, suivi d’une relaxation de 1,5 seconde.Le modèle de diffraction des rayons X musculaires peut donner des informations structurelles de résolution nanométrique à partir de structures à l’intérieur du sarcomere. Les lignées de couches à base de myosine contenant des filaments épais sont fortes et nettes dans les modèles du muscle de repos, tandis que les lignes de couche à base d’actine contenant des filaments minces sont plus importantes dans les modèles du muscle contractant. Les modèles de différence obtenus en soustrayant le modèle de repos du modèle de contraction peuvent faire la lumière sur des changements structurels pendant le développement de force dans le muscle sain et maladie.En suivant ces changements structurels à l’échelle de temps milliseconde des événements moléculaires pendant la contraction et la relaxation de muscle, les modèles de diffraction de rayon X peuvent révéler l’information structurale substantielle. Dans cette analyse représentative des réflexions équatoriales à l’aide de la routine équateur dans le paquet Open source MuscleX, le rapport d’intensité équatoriale indique la proximité de la myosine à l’actine dans le muscle au repos et est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés dans le contrat du muscle squelettique murin. La distance entre les deux 1, 0 réflexion est inversement liée à l’espacement de l’interfilament.Une dissection propre est la clé d’une expérience de radiographie musculaire intacte réussie, alors essayez d’éviter tout dommage mécanique pendant la préparation musculaire. N’importe quel protocole physiologique standard avec des muscles entiers peut être mis en œuvre dans ces expériences et peut être utilisé pour étudier l’activation musculaire, la relaxation et le comportement inter-pont pendant l’éphémère mécanique rapide. La manipulation génétique des souris devient de plus en plus sophistiquée.De nouveaux modèles de souris transgéniques permettront de créer des expériences plus spécifiques et perspicaces pour indiquer de nouvelles orientations thérapeutiques pour les myopathies humaines.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...