Name: in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae
Uploaded: 2018-02-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

Nous remercions Manuela Weitkunat pour l’acquisition de film S3. Nous sommes reconnaissants à Reinhard Fässler pour le soutien généreux. Ce travail a été soutenu par l’EMBO Young Investigator programme (F.S.), le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la Société Max Planck (S.B.L., F.S.), le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l’initiative d’excellence Aix-Marseille Université AMIDEX (F.S.), le LabEX-INFORM (F.S.) et le Fonds de Ingelheim Boehringer (S.B.L.).

1. nymphes de l’étape
<ol><li>Mettre en place un croisement avec les femelles vierges de 20-40 et environ 20 hommes par bouteille de nourriture volée (Figure 1 a). Alternativement, si les stocks doit servir, mettez chaque stock dans de nouvelles bouteilles. Pour obtenir suffisamment de pupes, pensez à définir deux bouteilles par génotype.</li>
	<li>Incuber les flacons à 25 ° C (ou 27 ° C, selon le protocole expérimental) pendant cinq à six jours (Figure 1 b). NOTE : Gardez renversant les mouches tous les deux ou trois jours pour éviter la surpopulation et d’assurer un approvisionnement continu des pupes.</li>
	<li>Utilisez un pinceau humide pour recueillir les prénymphes blancs des parois des bouteilles et les transférer sur les lames de verre (Figure 1). La mise en scène du temps tel que les nymphes atteignent le désiré d’âge lors du démarrage direct imaging sous le microscope. Remarque : Ces prénymphes ressemblent à des nymphes âgées en fonction de leur forme, mais elles sont toujours blanches comme des larves. Le début de la phase prénymphal est défini comme 0 h après formation puparium (0 h CSA).</li>
	<li>Enlever les amas de nourriture mouche s’en tenir à la chrysalide avec un pinceau humide et orienter la face ventrale de la pupe vers la lame de verre à l’aide d’un stéréomicroscope (Figure 1). Jetez les nymphes qui sont toujours en mouvement (trop jeune) ou qui ont commencé à virer au brun (trop vieux). Cela garantit que toutes les nymphes ont le même âge (0 - 1 h CSA).</li>
	<li>Étiqueter les diapositives avec génotype, date et heure du Recueil. Transférer les lames de verre pour un plat de Pétri et ajouter un chiffon humide pour éviter que les pupes de se dessécher (Figure 1E).</li>
	<li>Stocker les pupes dans un incubateur à 25 ° C ou 27 ° C jusqu'à ce qu’ils atteignent l’âge désiré. Continuer avec les étapes suivantes 1 h avant l’imagerie, afin que les nymphes ont voulu l’âge lors du démarrage direct imaging (étape 3), par exemple à 13 h CSA pour le film illustré à la Figure 2 a-D. NOTE : Le plus tôt possible temps départ est après tête-éversion de la pupe se produisant à 8-10 h CSA à 27 ° C.</li>
</ol>2. préparer les pupes d’imagerie
<ol><li>Veiller à ce que la pupe est maintenant colle à la lame de verre, comme naturellement, ils collent aux parois des bouteilles à cause de la nourriture mouche résiduelle. Pas de colle supplémentaire n’est requis. Si les nymphes ne collent pas assez bien à cause de la forte humidité, ouvrez la boîte de Pétri pendant quelques minutes pour laisser sécher. Vous pouvez également transférer sur ruban adhésif double-face sur une lame de verre, mais habituellement, ce n’est pas nécessaire.</li>
	<li>
Fenêtre ouverte dans la pupe pour l’imagerie des muscles de vol indirect (Figure 1F; Passez à la section 2.3 pour l’imagerie des muscles abdominaux).<ol>
<li>Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure loin le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.</li>
		<li>À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où l’abdomen se termine, et le thorax commence.</li>
		<li>Pour trancher ouvert la pupe, doucement déplacer la pince à l’extrémité antérieure du thorax, le long de l’aile, mais éviter d’endommager les tissus vulnérables aile. Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe.</li>
		<li>Lever de la section de la pupe au-dessus du thorax avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fenêtre ouverte en pupe pour l’imagerie des muscles abdominaux (Figure 1)<ol>
<li>Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure vers le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.</li>
		<li>À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où finit le thorax et l’abdomen commence.</li>
		<li>Pour trancher ouvert la pupe, déplacez doucement la pince vers l’extrémité postérieure de l’abdomen. Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe.</li>
		<li>Lever de la section de la pupe au-dessus de l’abdomen avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage de nymphes (Figure 1 H)<ol>
<li>Un pinceau humide permet de transférer jusqu'à cinq nymphes d’une glissière en plastique avec une rainure (voir Custom-Built, réutilisable, l’analyse et liste des matériaux). Ajouter une ou deux lamelles de cale d’espacement de chaque côté selon l’épaisseur de la pupe et de la profondeur de la rainure. Mettre une petite goutte d’eau sous chaque entretoise lamelle couvre-objet pour le faire coller à la diapositive et laisser de l’espace entre le groove et les lamelles de l’entretoise de chaque côté. Remarque : Les lamelles de l’entretoise peut également être fixé en permanence à la diapositive avec la super colle, à l’avance.</li>
		<li>Orienter les pupes telle que l’ouverture dans la pupe fait face vers le haut à l’aide de la brosse. Assurer un positionnement attentif de la pupe à l’angle correct pour la bonne qualité d’imagerie. Optimiser l’angle pour chaque tissu et chaque point dans le temps du développement. Remarque : Une petite quantité d’eau dans la rainure rend plus facile de positionnement de la pupe. Égoutter le surplus d’eau avec la brosse ensuite pour éviter la noyade.</li>
		<li>Tenir un lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) au-dessus de la pupe sans y toucher. Placer de petites gouttelettes (environ 0,5 µL) de solution de glycérol à 50 % au-dessus de chaque pupe ouvrant sur la lamelle couvre-objet à l’aide d’une pipette 20 µL. Remarque : Cette procédure s’assure que les gouttelettes ont le même espacement que les nymphes.</li>
		<li>Retournez la lamelle et positionnez-le au-dessus de la pupe à la main ou avec une pincette (standard #5) tout en se reposant d’un côté de la lamelle couvre-objet sur l’entretoise lamelles couvre-objet à côté de la pupe. Ensuite, doucement tomber la lamelle sur la pupe. S’assurer que les ouvertures affaire pupes sont correctement couvert avec 50 % de glycérol pour imagerie de bonne qualité et pour éviter que les pupes ne se dessèchent pas.</li>
		<li>Pliez sur une extrémité d’un morceau de ruban adhésif et l’attraper avec une pince (standard #5) à cette fin. Placez délicatement la bande tels qu’elle recouvre une extrémité de la lamelle supérieure, la coverslip(s) de l’entretoise et la lame en plastique sur un côté. N’appuyez pas vers le bas de la bande, encore. Tout d’abord, tournez la diapositive et répéter pour l’autre côté.</li>
		<li>Utiliser deux doigts pour appuyer la bande simultanément sur les deux côtés. Cette procédure garantit que les nymphes ne sont pas déplacés.</li>
		<li>Vérifiez que les nymphes soient bien en contact avec la lamelle. Pour une qualité optimale d’imagerie les pupes doivent être pressés doucement sous la lamelle. Ajuster le nombre de lamelles entretoise si nécessaire.</li>
		<li>L’étiquette de la diapositive en écrivant sur le ruban adhésif.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vivre d’imagerie des chrysalides
<ol><li>La méthode de montage permet l’imagerie de la pupe des microscopes inversés (Figure 1I) tant sur les microscopes verticale (Figure 1J). Particulièrement adapté à l’imagerie live numérisez microscopes confocaux, deux photons microscopes et microscopes confocaux de rotation disque indépendamment de savoir si ils sont inversés ou redressée. Pour les films à long terme, utiliser une étape de contrôle de la température, si disponible.</li>
	<li>À l’aide de l’oculaire et une lampe UV ou la transmission lumineuse, repérez une chrysalide et la mise au point à l’intérieur de la chrysalide.</li>
	<li>À l’aide de la caméra, trouver la structure désirée et ajustez le niveau de zoom.</li>
	<li>Pour les films à long terme, définir une z-pile qui englobe la structure d’intérêt bien (par exemple, les muscles de vol indirect, leurs sites de fixation, les cellules de tendon ou une combinaison de ce qui précède) et choisissez un intervalle de temps. Envisager de faire une moyenne pour une meilleure qualité d’image. Pour les films à grande vitesse, à court terme, choisissez un seul z-plan pour atteindre un taux de rafraîchissement élevé.</li>
	<li>Ajuster la puissance du laser pour donner le meilleur signal possible mais peu de saturation. Cependant, puissance du laser trop élevé peut endommager la nymphe au fil du temps.</li>
	<li>Démarrez l’imagerie et retourner de temps en temps pour vérifier le film et réajuster le positionnement de z-pile si nécessaire.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Figure 1 : flux de travail pour l’imagerie Webcam live de la morphogénèse du muscle-tendon en pupes de Drosophila . Voir le protocole pour plus de détails. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté décrit l’image morphogenèse de muscle-tendon vie pupes de drosophile en utilisant une variété de protéines fluorescent étiquetées. Cette in vivo stratégie d’imagerie peut être utilisé pour étudier les processus de développement dans leur milieu naturel de l’organisme tout entier.
Il est crucial pour une expérience réussie trouver le point du développement de bonne heure à analyser. Par exemple, les muscles du vol indirect dorsolongitudinaux initialisent attachement à leurs cibles de tendon à ≈16 h CSA23 tandis que les muscles abdominaux se développent plus tard et les attachent aux deux extrémités qu’entre 30 et 40 h CSA26. Par conséquent, littérature publiée antérieurement doit être utilisée pour trouver les points de bon moment de développement pour analyser ou, si le tissu ou une structure d’intérêt n’a pas été étudiée en détail avant, le développement global doit être caractérisé d’abord.
Pour les nymphes de montage avec succès sur les glissières en plastique sur mesure, il est important que les rainures ont une taille convenable : le rainures doivent être 1,0-1,5 mm de large et 0,3 - 0,4 mm de profondeur. Cette profondeur permet d’ajuster la distance précise de la lamelle supérieure avec entretoise lamelles selon les besoins. Toutefois, au moins une entretoise lamelle devrait servir à éviter de vider le glycérol à 50 % de l’échantillon par des forces capillaires. Le positionnement correct de la pupe dans la rainure nécessite certaines expérience et doivent être optimisées de telle sorte que la structure d’intérêt est aussi proche que possible de la lamelle.
Si un grand nombre de nymphes est censé être photographiée sur la session d’un microscope, ils peuvent tous être montés au préalable et ensuite conservées dans un incubateur jusqu'à l’imagerie afin d’assurer la bonne synchronisation du développement. Les pupes devraient survivre à l’ensemble de la procédure et aussi au moins essayer d’eclose si gardé sur la diapositive après l’imagerie. Le taux de survie peut servir comme une lecture pour vérifier si les conditions d’imagerie nuisent les pupes.
Les paramètres d’imagerie doivent être choisis avec soin selon les conditions expérimentales. Pour les films à court terme, une fréquence d’images élevée par rapport à un rapport signal sur bruit élevé doit être équilibré, alors que la puissance relativement élevée de laser peut être utilisé sans endommager les pupes trop. Toutefois, pour les films à long terme, la puissance du laser doit être maintenu à un niveau modéré et les pupes ne doivent pas être photographiés en permanence mais plutôt à certains moments, par exemple, toutes les 20 min. Pour vous assurer que la structure d’intérêt ne se déplace pas hors du champ de vision, il peut être nécessaire de réajuster le positionnement de la z-pile entre points dans le temps. À notre connaissance, l’ouverture de la pupe en soi n’affecte pas calendrier du développement. Toutefois, une étape à température contrôlée devrait servir pour films à long terme pour assurer la bonne synchronisation du développement. Gardant ces considérations à l’esprit, très instructifs films peuvent être acquises.
Le protocole présenté permet de visualiser non seulement morphogenèse de muscle-tendon, mais aussi d’autres tissus en voie de développement, par exemple, l’aile épithélium29. Seulement trois modifications au présent protocole sont requises : (1) ouverture de la pupe au-dessus de l’aile au lieu du thorax ou l’abdomen, (2) positionnement des nymphes avec l’aile vers la lamelle supérieure et (3) l’utilisation de marqueur fluorescent différentes protéines. Avec l’avancement de la technologie CRISPR/Cas9, plus endogène étiquetés protéines fluorescentes seront disponibles, parce qu’il est devenu plus simple cibler des loci endogènes chez Drosophila30,31 , 32. dans l’avenir, ce qui permettra d’élucider la dynamique de nombreuses protéines, de cellules et de tissus ensemble dans leur environnement physiologique en détail.

L’appareil muscle-tendon permet aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Les blocs de construction moléculaires du système tendon-muscle sont très conservés. Par conséquent, concepts du développement de muscle-tendon pertinente pour la biologie du muscle humain, par exemple la morphogenèse muscle muscle-tendon et l’auto-organisation myofibrillaire, peuvent être étudiés à l’aide de Drosophila melanogaster comme un facilement accessible système de modèle. Le système de pupes de drosophile a plusieurs avantages expérimentales. Tout d’abord, au stade nymphal – lorsque les muscles adultes sont constitués – l’organisme est sessile et donc faciles à l’image sur un microscope pendant des heures voire des jours. En second lieu, forme beaucoup de muscles assez sous la surface de pupe proche de sorte qu’ils peuvent être photographiés à l’intérieur de l’organisme intact, partiellement translucide. Troisièmement, les muscles peuvent être étudiées dans leur environnement naturel, où ils sont connectés à l’exosquelette formant par l’intermédiaire de cellules de tendon et tension des tissus est construite. Ce n’est pas possible dans les systèmes de culture des cellules musculaires. Et enfin, il existe une pléthore d’outils génétiques chez la drosophile. Parmi ceux-ci figurent plusieurs marqueurs fluorescent étiquetés permettant l’étiquetage des types spécifiques de cellules ou structures subcellulaires d’imagerie in vivo.
Le tableau 1 résume les principaux marqueurs utilisés pour l’étude de la morphogénèse de muscle-tendon. Il comprend les marqueurs surexprimés utilisant le système GAL4-UAS1 et endogène tag protéines marqueurs2,3,4. L’avantage du GAL4-UAS-système est que les marqueurs sont généralement exprimés à des niveaux élevés, ayant pour résultat un signal fort qui peut facilement être photographié en entier-Montez pupes. En outre, spécificité tissulaire est possible en choisissant soigneusement les pilotes GAL4. L’avantage des protéines de fusion exprimés sous contrôle endogène est que la dynamique des protéines respectifs peut être étudiés en vivo, elles aussi peuvent être utilisés comme marqueurs pour différents types de cellules ou structures subcellulaires spécifiques, par exemple, ΒPS-intégrine-GFP pour sites d’attachement musculaires. Ensemble, ces marqueurs offrent une grande flexibilité dans la conception expérimentale et le choix des problèmes de recherche qui peut être résolu maintenant et dans l’avenir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Structure de l’étiquette</td>
			<td colspan="2">Marqueur</td>
			<td colspan="2">Expression et localisation</td>
			<td colspan="2">Classe</td>
			<td colspan="2">Numéro de stock</td>
			<td colspan="2">Commentaire</td>
			<td>Réf.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Muscle</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">tous les myoblastes et tous les muscles à tous les stades</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">précurseurs de muscle adulte et des myotubes début jusqu'à ≈24 h CSA</td>
			<td colspan="2">Ligne de GAL4, piège d’enhancer</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">sauter le muscle à la différenciation</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">Enhancer Act88F / promoteur conduite Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Ca2 + indicateur</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 et fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Lui- nls-GFP</td>
			<td colspan="2">précurseurs de muscle adulte, nucléaires, jusqu'à ≈24 h CSA dans les muscles de vol indirect</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promoteur avec journaliste nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">fragment de renforceur de 1,5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules dans les modèles de DLM et pour différencier les muscles</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promoteur avec journaliste Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules dans les myotubes (par exemple dans les muscles du vol indirect de h ≈14 AFP, diminuant fortement après ≈48 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomères (filament épais) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-piège</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Utilisez hétérozygote, un sous-ensemble de l’isoforme des étiquettes</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomères (Z-disque) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, utilisation hétérozygote</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disque dans tous les muscles du corps</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disque dans tous les muscles du corps</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine ; exprimée dans l’épithélium, les myoblastes et les myotubes</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">jonctions de cellules épithéliales, les myoblastes et les membranes dans les muscles à tous les stades</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Site d’attachement de muscle</td>
			<td colspan="2">ΒPS-intégrine-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-knock-in</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP et mCherry-</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne MiMIC)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ILK-GFP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP et - DP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (transgène)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendon</td>
			<td colspan="2">
SR-GAL4</td>
			<td colspan="2">cellules de tendon de thorax, tout au long de la chrysalide</td>
			<td colspan="2">Ligne de GAL4, piège d’enhancer</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozygotes létale</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Musculaires et tendineuses</td>
			<td colspan="2">
DUF-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscles et épithéliums, précoce</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">kirre-rP298, marqueur de cellules fondateur</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">SAMU-reporters</td>
			<td colspan="2">
SAMU- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">domaine de liaison de l’actine de la moésine fusionnée à la GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA fusionnée à mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">divers stocks, par exemple : BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 27391 et 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-palm-mCherry</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane par l’intermédiaire de palmitoylation</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
SAMU- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Tag fluorescent marqueurs protéiques pour l’étude muscle-tendon morphogenèse in vivo.
Ici, nous décrivons en détail comment l’imagerie de la morphogénèse du muscle-tendon en nymphes vivantes peut être effectuée facilement et avec succès (Figure 1). Alternativement, les pupes peuvent être fixés, disséqué et immunomarquage, qui permet en utilisant des anticorps d’également étiqueter les protéines pour lesquelles aucun vivre marqueurs sont disponibles22. Dans ce cas, la qualité d’image est généralement plus élevée, car il n’y a pas de mouvement et la structure d’intérêt peut être placée à proximité immédiate de la lamelle. Cependant, dissection et fixation peuvent mener aux dommages et moléculaire ou dynamique du tissu, par exemple, musculaires, ne peut être étudiée dans l’organisme vivant.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>product has been replaced by Leica M60</td></tr><tr><td>fly food in bottles (or vials)</td><td>-</td><td>-</td><td>standard culture medium</td></tr><tr><td>paint brush</td><td>da Vinci</td><td>1526Y</td><td>size 1</td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>VWR: 631-1303</td><td>76 x 26 mm</td></tr><tr><td>double-sided tape (optional)</td><td>Scotch</td><td>6651263</td><td>12 mm x 6.3 m</td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632102</td><td>94 x 16 mm</td></tr><tr><td>paper tissues</td><td>Th.Geyer</td><td>7695251</td><td></td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td>straight tip</td></tr><tr><td>plastic slides with a groove (reusable)</td><td>custom-built</td><td>-</td><td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>107032</td><td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49781</td><td>dilute to 50 % in water</td></tr><tr><td>adhesive tape</td><td>Tesa</td><td>57370-02</td><td>1.5 mm x 10 m</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Ainsi que les tendons et le squelette, les muscles aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Morphogenèse de muscle est hautement conservée des animaux aux humains. Par conséquent, le puissant système de modèle drosophile permet d’étudier les concepts du développement de muscle-tendon qui peut également être appliquée à la biologie du muscle humain. Ici, nous décrivons en détail comment la morphogénèse du système tendon-muscle adulte peut être facilement photographiée sur la vie, développer des pupes de drosophile . Donc, la méthode permet d’enquêter sur les protéines, les cellules et les tissus dans leur environnement physiologique. Outre un protocole étape par étape avec des conseils utiles, nous donnent un aperçu complet des protéines de marqueur fluorescent étiqueté qui conviennent pour l’étude du système tendon-muscle. Pour mettre en évidence les multiples applications du protocole, nous montrer des films exemple allant de visualisation d’événements morphogénétiques à long terme – qui se produisent à l’échelle de temps des heures et des jours – à la visualisation des manoeuvres dynamiques comme les contractions musculaires qui se produisent sur une échelle de temps de secondes. Globalement, ce protocole devrait permettre au lecteur de concevoir et de réaliser des expériences d’imagerie live pour enquêter sur la morphogenèse muscle-tendon dans l’organisme intact.

Divers tissus peuvent être imagé in vivo dans le développement des mouches nymphes, ce qui les rend un système modèle idéal pour étudier la morphogenèse des organes adultes. Parmi ceux-ci sont les muscles de vol indirect, l’épithélium de thorax, y compris les cellules de tendon, l’épithélium de l’aile, muscles abdominaux et le coeur22,23,24,25,26 , 27. ici, nous nous concentrons sur l’imagerie Webcam live de la morphogénèse musculaires et tendineuses. Pour une description détaillée des muscles de vol indirect et morphogenèse des muscles abdominaux et des méthodes supplémentaires pour étudier la biologie du muscle chez la drosophile, nous renvoyons le lecteur à Weitkunat et Schnorrer 201422.
Vivre d’imagerie des muscles de vol indirect
Pour étudier le développement à long terme des muscles du vol indirect comprenant les muscles dorsolongitudinaux (DLMs) et les muscles dorsoventral (DVMs), globulaire moésine domaine de liaison de l’actine tag avec GFP (SAMU -GFP-Gma) a été exprimé dans tous les muscles en utilisant le facteur de renforceur de Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 pilote (Figure 2 a-D, Film S1). Avant l’imagerie, une fenêtre dans la pupe a été ouverte au-dessus de la cage thoracique, comme sur la Figure 1F. Sur un microscope biphotonique, z-cheminées ont été acquis toutes les 20 min de 21 h à partir de ≈11 h après formation puparium (11 h CSA). Dans ce laps de temps, les DLMs (vert superpositions en Figure 2 a'-D') tout d’abord ouvrir la pièce jointe aux cellules tendineux (Figure 2 a) et ensuite divisé alors que les attaches musculaires matures (Figure 2 b). Ensuite, les myotubes raccourcir (Figure 2) jusqu'à ce qu’ils atteignent enfin la scène compactée au maximum à 30 h CSA (Figure 2D). Pris ensemble, ce film met en lumière des bouleversements dans la morphologie du muscle qui se produisent à l’échelle de temps d’heures.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Figure 2 : imagerie de la morphogénèse musculaires et tendineuses de vol indirect en direct. (A-D) Fois points d’un film de deux photons (film S1) à l’aide de Mef2-GAL4, SAMU- GFP-Gma comme marqueur pour l’actine dans les muscles de vol indirect consistant en les muscles dorsolongitudinaux (DLMs, surlignés en vert a "-D") et les muscles dorsoventral ( DVMs, surlignés en bleu a "-D"). Barreaux de l’échelle est de 100 µm. (E-H) moments d’un film de deux photons (film S2) à l’aide de Duf-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur des muscles du vol indirect et l’épithélium du thorax dont les cellules du tendon. Panneaux E'-H' afficher une incrustation avec un modèle du système tendon-muscle à chaque moment, mettant en évidence les extensions longues cellulaires formée par l’épithélium du tendon (magenta) en contact avec les muscles (vert). Barreaux de l’échelle est de 100 µm (estimée à partir des dimensions des structures de représentation). (J’ai-L) Fois les points d’un film confocal bicolore, tourne disque (film S3) mettant l’accent sur l’initiation de muscle-tendon accessoire. Les cellules de tendon sont étiquetés avec sr-GAL4SAMU-palm-mCherry (magenta) et le dorsolongitudinaux indirecte vol muscles avec Mhc -Tau-GFP (en vert). Barreaux de l’échelle est de 10 µm. le temps est indiqué comme hh : mm après formation puparium (APF). Notez que pas tous les films ont été acquis sur une étape de contrôle de la température, par conséquent, le calendrier du développement peut-être diverger. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour l’étude de morphogenèse tendon et le muscle en même temps, liée à la membrane GFP (SAMU -CD8-GFP) a été exprimé en Dumbfounded (Duf)-GAL4 comme chauffeur, qui s’exprime aussi bien dans les cellules des tendons et des muscles de vol indirect (Figure 2E -H, film S2). Une z-pile a été prise sur un microscope biphotonique toutes les 20 min à partir de 16 h CSA pour 20 h. Alors que les myotubes compact (overlay vert dans la Figure 2E'-H'), le tendon de cellules forme extensions longues cellulaire qui s’allongent avec le temps (magenta superposition dans Figure 2E'-H'). Pris ensemble, ce film met en lumière l’étroite interaction entre le tendon et le muscle cellules in vivo.
Pour étudier l’interaction des muscle-tendon plus en détail, deux couleurs, fort grossissement imagerie a été réalisée. Nymphes avec chaîne lourde de myosine (Mhc)-Tau-GFP dans la DLMs et SAMU -palmitoylées-mCherry (SAMU -palm-mCherry), conduit par stripe (sr)-GAL4 dans les tendons ont été photographié toutes les 5 min à partir de 12 h CSA pendant 4,5 heures sur un disque de rotation microscope confocal (Figure 2I-L, film S3). A 12 h CSA, les myotubes migrent vers leurs cellules cibles de tendon tout en formant de longs filopodes à leur extrémité (Figure 2I). Par la suite, les muscle et le tendon tissus pavimenteuses (Figure 2J, K) pour former une fixation stable. Avec la maturation de la pièce jointe, moins filopodes forme et l’interface de tendon-muscle lisse (Figure 2 L). Ainsi, l’imagerie bicolore, fort grossissement peut être utilisé pour révéler la dynamique cellulaire en détail dans l’organisme vivant.
Vivre la formation image des muscles abdominaux
Pour l’imagerie direct des muscles abdominaux (Figure 3film S4), Mef2-GAL4> SAMU-CD8-GFP a été utilisé comme un marqueur et une fenêtre a été ouverte au-dessus de l’abdomen dans la pupe comme indiqué dans la Figure 1. Comme dans le film de muscles de vol indirect représenté dans la Figure 2 a-D, la formation et la croissance des muscles abdominaux peuvent être suivis au cours de nombreuses heures de développement (h 55 dans film S4). Pendant ce temps, les myoblastes fusionnent pour former de plus en plus les myotubes (Figure 3 a). Les conseils de myotubes migrent vers leurs cibles de tendon, et après avoir branché sur les cellules de tendon, sont forment les unités contractiles des muscles, les sarcomères, (Figure 3 b-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Figure 3 : vivre l’imagerie de la morphogénèse des muscles abdominaux. (A-D) Fois les points d’un film (film S4) à l’aide de Mef2-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur pour suivre la morphogenèse des muscles abdominaux. Panneaux A'-E' afficher les superpositions avec les modèles d’un ensemble de muscles abdominaux (vert) qui se forme en reprenant le stade pupal. Barreaux de l’échelle est de 100 µm. le temps est indiqué comme hh : mm CSA. Le film a été acquis à la température ambiante. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Vivre d’imagerie des contractions des muscles
Contrairement à la Figure 2 et Figure 3, Figure 4 montre la dynamique musculaire survenant à l’échelle de temps de secondes : l’enregistrement live de contractions musculaires. Nymphes exprimant βPS-intégrine-GFP sous contrôle endogène ont été photographiés avec une résolution temporelle de 0,65 s dans un seul plan z sur un microscope confocal (Film S5). Dans l’exemple illustré à la Figure 4, les sites de fixation de trois DVMs (Figure 4 a) ont été projetés pendant 10 min à partir de 42 h CSA. Pendant ce temps, contraction de cinq événements ont été observés (Figure 4 b-F), montrant que les sarcomères sont déjà assemblés assez bien pour soutenir les contractions coordonnées à ce point dans le temps dans le développement. Par conséquent, imagerie des contractions musculaires peut servir une lecture fonctionnelle pour sarcomerogenesis déjà pendant le développement musculaire vol indirect28, par opposition à par exemple essais en vol, qui ne peut être effectuée qu’après l’éclosion.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Figure 4 : imagerie des contractions des muscles en direct. (A) tout d’abord-point dans le temps d’un film (film S5) montrant les contractions des muscles de vol indirect dorsoventral à 42 h CSA en utilisant βPS-intégrine-GFP comme marqueur. Dans le champ de vision est le muscle sites d’attachement de DVM II 2, DVM III 1 et DVM III 2. (B-F) La couleur des superpositions de cinq épreuves individuelles de secousse, chacun montrant le cadre avant la secousse (magenta) et la première image de l’événement de la secousse (vert). Notez que les fibres musculaires individuels se contracter indépendamment les uns des autres. Flèches mettent en évidence le mouvement de contractions. La résolution temporelle du film est de 0,65 s. barres d’échelle sont 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Imagerie des protéines étiquetées de manière endogène en direct
Semblable à βPS-intégrine-GFP, une grande collection de protéines de fusion exprimés chez la drosophile sous contrôle endogène a été généré2,3,4. Ces lignes de mouche peuvent être utilisés pour étudier par exemple la localisation subcellulaire ou les profils d’expression des protéines d’intérêt. La collection est particulièrement utile si les anticorps spécifiques ne sont pas disponibles ou la dynamique des protéines doit être étudiés en vivo sans fixation. La figure 5 illustre trois exemples des protéines de fusion exprimée de façon endogène de la mouche TransgeneOme (fTRG) bibliothèque, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figure 5 a, B), Talin-GFP (Figure 5, D) et βTubulin60D-GFP ( Figure 5E, F). L’expression de ces protéines peut être étudiée dans tous les tissus qui les expriment naturellement. Ici, nous montrons l’épithélium du thorax (Figure 5 aC, E) et les muscles du vol indirect ou leurs sites de fixation (Figure 5 bD, F) comme exemples.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Figure 5 : imagerie Live de façon endogène tag protéines. (A, B) Maximums de prises des pupes exprimant Hts-GFP de z-cheminées. (C, D) Maximums de prises des pupes exprimant Talin-GFP de z-cheminées. (E, F) Maximums de prises des pupes exprimant βTubulin60D-GFP de z-cheminées. Panneaux A, C E montrent l’épithélium du thorax à 18, 24 et 18 h CSA, respectivement et panneaux B, D et F montrent les muscles de vol indirect ou leurs sites de fixation à 30 h CSA. Barreaux de l’échelle est 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K vues.  Max Planck Institute of Biochemistry. Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .

Vidéo: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Recherche

Biologie du développement

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Génétique

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biologie

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imagerie en direct étendue de la morphogenèse de la patte de la drosophile sans puparium

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Découvrir les structures épithéliales dynamiques au cours du développement de la drosophile

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imagerie en direct à long terme du développement de la patte de la drosophile après l’ablation du puparium

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

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Live-imagerie de la

À long terme d'imagerie en direct de

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L'imagerie du développement Drosophile

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

L'imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Imagerie en direct à long terme du développement de la patte de la drosophile après l’ablation du puparium

Imagerie en direct à long terme du développement de la patte de la drosophile après l’ablation du puparium

Imagerie en direct à long terme du développement de la patte de la drosophile après l’ablation du puparium