Nous remercions Manuela Weitkunat pour l’acquisition de film S3. Nous sommes reconnaissants à Reinhard Fässler pour le soutien généreux. Ce travail a été soutenu par l’EMBO Young Investigator programme (F.S.), le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la Société Max Planck (S.B.L., F.S.), le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l’initiative d’excellence Aix-Marseille Université AMIDEX (F.S.), le LabEX-INFORM (F.S.) et le Fonds de Ingelheim Boehringer (S.B.L.).

1. nymphes de l’étape
<ol><li>Mettre en place un croisement avec les femelles vierges de 20-40 et environ 20 hommes par bouteille de nourriture volée (Figure 1 a). Alternativement, si les stocks doit servir, mettez chaque stock dans de nouvelles bouteilles. Pour obtenir suffisamment de pupes, pensez à définir deux bouteilles par génotype.</li>
	<li>Incuber les flacons à 25 ° C (ou 27 ° C, selon le protocole expérimental) pendant cinq à six jours (Figure 1 b). NOTE : Gardez renversant les mouches tous les deux ou trois jours pour éviter la surpopulation et d’assurer un approvisionnement continu des pupes.</li>
	<li>Utilisez un pinceau humide pour recueillir les prénymphes blancs des parois des bouteilles et les transférer sur les lames de verre (Figure 1). La mise en scène du temps tel que les nymphes atteignent le désiré d’âge lors du démarrage direct imaging sous le microscope. Remarque : Ces prénymphes ressemblent à des nymphes âgées en fonction de leur forme, mais elles sont toujours blanches comme des larves. Le début de la phase prénymphal est défini comme 0 h après formation puparium (0 h CSA).</li>
	<li>Enlever les amas de nourriture mouche s’en tenir à la chrysalide avec un pinceau humide et orienter la face ventrale de la pupe vers la lame de verre à l’aide d’un stéréomicroscope (Figure 1). Jetez les nymphes qui sont toujours en mouvement (trop jeune) ou qui ont commencé à virer au brun (trop vieux). Cela garantit que toutes les nymphes ont le même âge (0 - 1 h CSA).</li>
	<li>Étiqueter les diapositives avec génotype, date et heure du Recueil. Transférer les lames de verre pour un plat de Pétri et ajouter un chiffon humide pour éviter que les pupes de se dessécher (Figure 1E).</li>
	<li>Stocker les pupes dans un incubateur à 25 ° C ou 27 ° C jusqu'à ce qu’ils atteignent l’âge désiré. Continuer avec les étapes suivantes 1 h avant l’imagerie, afin que les nymphes ont voulu l’âge lors du démarrage direct imaging (étape 3), par exemple à 13 h CSA pour le film illustré à la Figure 2 a-D. NOTE : Le plus tôt possible temps départ est après tête-éversion de la pupe se produisant à 8-10 h CSA à 27 ° C.</li>
</ol>2. préparer les pupes d’imagerie
<ol><li>Veiller à ce que la pupe est maintenant colle à la lame de verre, comme naturellement, ils collent aux parois des bouteilles à cause de la nourriture mouche résiduelle. Pas de colle supplémentaire n’est requis. Si les nymphes ne collent pas assez bien à cause de la forte humidité, ouvrez la boîte de Pétri pendant quelques minutes pour laisser sécher. Vous pouvez également transférer sur ruban adhésif double-face sur une lame de verre, mais habituellement, ce n’est pas nécessaire.</li>
	<li>
Fenêtre ouverte dans la pupe pour l’imagerie des muscles de vol indirect (Figure 1F; Passez à la section 2.3 pour l’imagerie des muscles abdominaux).<ol>
<li>Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure loin le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.</li>
		<li>À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où l’abdomen se termine, et le thorax commence.</li>
		<li>Pour trancher ouvert la pupe, doucement déplacer la pince à l’extrémité antérieure du thorax, le long de l’aile, mais éviter d’endommager les tissus vulnérables aile. Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe.</li>
		<li>Lever de la section de la pupe au-dessus du thorax avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fenêtre ouverte en pupe pour l’imagerie des muscles abdominaux (Figure 1)<ol>
<li>Orienter les pupes coller à la lame de verre avec la face antérieure vers le chercheur sous un stéréomicroscope. Ajuster le zoom 2 X.</li>
		<li>À l’aide d’une des extrémités de la biologie de grade #5 pinces, doucement Enfoncez un trou dans la pupe dorsal à l’aile où finit le thorax et l’abdomen commence.</li>
		<li>Pour trancher ouvert la pupe, déplacez doucement la pince vers l’extrémité postérieure de l’abdomen. Remarque : Si le liquide fuit par la nymphe, il est endommagé ; Jetez-le et recommencer avec une autre nymphe.</li>
		<li>Lever de la section de la pupe au-dessus de l’abdomen avec la pince et puis coupez cette section avec des ciseaux fins et pointus sur le côté opposé de la ligne médiane dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage de nymphes (Figure 1 H)<ol>
<li>Un pinceau humide permet de transférer jusqu'à cinq nymphes d’une glissière en plastique avec une rainure (voir Custom-Built, réutilisable, l’analyse et liste des matériaux). Ajouter une ou deux lamelles de cale d’espacement de chaque côté selon l’épaisseur de la pupe et de la profondeur de la rainure. Mettre une petite goutte d’eau sous chaque entretoise lamelle couvre-objet pour le faire coller à la diapositive et laisser de l’espace entre le groove et les lamelles de l’entretoise de chaque côté. Remarque : Les lamelles de l’entretoise peut également être fixé en permanence à la diapositive avec la super colle, à l’avance.</li>
		<li>Orienter les pupes telle que l’ouverture dans la pupe fait face vers le haut à l’aide de la brosse. Assurer un positionnement attentif de la pupe à l’angle correct pour la bonne qualité d’imagerie. Optimiser l’angle pour chaque tissu et chaque point dans le temps du développement. Remarque : Une petite quantité d’eau dans la rainure rend plus facile de positionnement de la pupe. Égoutter le surplus d’eau avec la brosse ensuite pour éviter la noyade.</li>
		<li>Tenir un lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) au-dessus de la pupe sans y toucher. Placer de petites gouttelettes (environ 0,5 µL) de solution de glycérol à 50 % au-dessus de chaque pupe ouvrant sur la lamelle couvre-objet à l’aide d’une pipette 20 µL. Remarque : Cette procédure s’assure que les gouttelettes ont le même espacement que les nymphes.</li>
		<li>Retournez la lamelle et positionnez-le au-dessus de la pupe à la main ou avec une pincette (standard #5) tout en se reposant d’un côté de la lamelle couvre-objet sur l’entretoise lamelles couvre-objet à côté de la pupe. Ensuite, doucement tomber la lamelle sur la pupe. S’assurer que les ouvertures affaire pupes sont correctement couvert avec 50 % de glycérol pour imagerie de bonne qualité et pour éviter que les pupes ne se dessèchent pas.</li>
		<li>Pliez sur une extrémité d’un morceau de ruban adhésif et l’attraper avec une pince (standard #5) à cette fin. Placez délicatement la bande tels qu’elle recouvre une extrémité de la lamelle supérieure, la coverslip(s) de l’entretoise et la lame en plastique sur un côté. N’appuyez pas vers le bas de la bande, encore. Tout d’abord, tournez la diapositive et répéter pour l’autre côté.</li>
		<li>Utiliser deux doigts pour appuyer la bande simultanément sur les deux côtés. Cette procédure garantit que les nymphes ne sont pas déplacés.</li>
		<li>Vérifiez que les nymphes soient bien en contact avec la lamelle. Pour une qualité optimale d’imagerie les pupes doivent être pressés doucement sous la lamelle. Ajuster le nombre de lamelles entretoise si nécessaire.</li>
		<li>L’étiquette de la diapositive en écrivant sur le ruban adhésif.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vivre d’imagerie des chrysalides
<ol><li>La méthode de montage permet l’imagerie de la pupe des microscopes inversés (Figure 1I) tant sur les microscopes verticale (Figure 1J). Particulièrement adapté à l’imagerie live numérisez microscopes confocaux, deux photons microscopes et microscopes confocaux de rotation disque indépendamment de savoir si ils sont inversés ou redressée. Pour les films à long terme, utiliser une étape de contrôle de la température, si disponible.</li>
	<li>À l’aide de l’oculaire et une lampe UV ou la transmission lumineuse, repérez une chrysalide et la mise au point à l’intérieur de la chrysalide.</li>
	<li>À l’aide de la caméra, trouver la structure désirée et ajustez le niveau de zoom.</li>
	<li>Pour les films à long terme, définir une z-pile qui englobe la structure d’intérêt bien (par exemple, les muscles de vol indirect, leurs sites de fixation, les cellules de tendon ou une combinaison de ce qui précède) et choisissez un intervalle de temps. Envisager de faire une moyenne pour une meilleure qualité d’image. Pour les films à grande vitesse, à court terme, choisissez un seul z-plan pour atteindre un taux de rafraîchissement élevé.</li>
	<li>Ajuster la puissance du laser pour donner le meilleur signal possible mais peu de saturation. Cependant, puissance du laser trop élevé peut endommager la nymphe au fil du temps.</li>
	<li>Démarrez l’imagerie et retourner de temps en temps pour vérifier le film et réajuster le positionnement de z-pile si nécessaire.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Figure 1 : flux de travail pour l’imagerie Webcam live de la morphogénèse du muscle-tendon en pupes de Drosophila . Voir le protocole pour plus de détails. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté décrit l’image morphogenèse de muscle-tendon vie pupes de drosophile en utilisant une variété de protéines fluorescent étiquetées. Cette in vivo stratégie d’imagerie peut être utilisé pour étudier les processus de développement dans leur milieu naturel de l’organisme tout entier.
Il est crucial pour une expérience réussie trouver le point du développement de bonne heure à analyser. Par exemple, les muscles du vol indirect dorsolongitudinaux initialisent attachement à leurs cibles de tendon à ≈16 h CSA23 tandis que les muscles abdominaux se développent plus tard et les attachent aux deux extrémités qu’entre 30 et 40 h CSA26. Par conséquent, littérature publiée antérieurement doit être utilisée pour trouver les points de bon moment de développement pour analyser ou, si le tissu ou une structure d’intérêt n’a pas été étudiée en détail avant, le développement global doit être caractérisé d’abord.
Pour les nymphes de montage avec succès sur les glissières en plastique sur mesure, il est important que les rainures ont une taille convenable : le rainures doivent être 1,0-1,5 mm de large et 0,3 - 0,4 mm de profondeur. Cette profondeur permet d’ajuster la distance précise de la lamelle supérieure avec entretoise lamelles selon les besoins. Toutefois, au moins une entretoise lamelle devrait servir à éviter de vider le glycérol à 50 % de l’échantillon par des forces capillaires. Le positionnement correct de la pupe dans la rainure nécessite certaines expérience et doivent être optimisées de telle sorte que la structure d’intérêt est aussi proche que possible de la lamelle.
Si un grand nombre de nymphes est censé être photographiée sur la session d’un microscope, ils peuvent tous être montés au préalable et ensuite conservées dans un incubateur jusqu'à l’imagerie afin d’assurer la bonne synchronisation du développement. Les pupes devraient survivre à l’ensemble de la procédure et aussi au moins essayer d’eclose si gardé sur la diapositive après l’imagerie. Le taux de survie peut servir comme une lecture pour vérifier si les conditions d’imagerie nuisent les pupes.
Les paramètres d’imagerie doivent être choisis avec soin selon les conditions expérimentales. Pour les films à court terme, une fréquence d’images élevée par rapport à un rapport signal sur bruit élevé doit être équilibré, alors que la puissance relativement élevée de laser peut être utilisé sans endommager les pupes trop. Toutefois, pour les films à long terme, la puissance du laser doit être maintenu à un niveau modéré et les pupes ne doivent pas être photographiés en permanence mais plutôt à certains moments, par exemple, toutes les 20 min. Pour vous assurer que la structure d’intérêt ne se déplace pas hors du champ de vision, il peut être nécessaire de réajuster le positionnement de la z-pile entre points dans le temps. À notre connaissance, l’ouverture de la pupe en soi n’affecte pas calendrier du développement. Toutefois, une étape à température contrôlée devrait servir pour films à long terme pour assurer la bonne synchronisation du développement. Gardant ces considérations à l’esprit, très instructifs films peuvent être acquises.
Le protocole présenté permet de visualiser non seulement morphogenèse de muscle-tendon, mais aussi d’autres tissus en voie de développement, par exemple, l’aile épithélium29. Seulement trois modifications au présent protocole sont requises : (1) ouverture de la pupe au-dessus de l’aile au lieu du thorax ou l’abdomen, (2) positionnement des nymphes avec l’aile vers la lamelle supérieure et (3) l’utilisation de marqueur fluorescent différentes protéines. Avec l’avancement de la technologie CRISPR/Cas9, plus endogène étiquetés protéines fluorescentes seront disponibles, parce qu’il est devenu plus simple cibler des loci endogènes chez Drosophila30,31 , 32. dans l’avenir, ce qui permettra d’élucider la dynamique de nombreuses protéines, de cellules et de tissus ensemble dans leur environnement physiologique en détail.

L’appareil muscle-tendon permet aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Les blocs de construction moléculaires du système tendon-muscle sont très conservés. Par conséquent, concepts du développement de muscle-tendon pertinente pour la biologie du muscle humain, par exemple la morphogenèse muscle muscle-tendon et l’auto-organisation myofibrillaire, peuvent être étudiés à l’aide de Drosophila melanogaster comme un facilement accessible système de modèle. Le système de pupes de drosophile a plusieurs avantages expérimentales. Tout d’abord, au stade nymphal – lorsque les muscles adultes sont constitués – l’organisme est sessile et donc faciles à l’image sur un microscope pendant des heures voire des jours. En second lieu, forme beaucoup de muscles assez sous la surface de pupe proche de sorte qu’ils peuvent être photographiés à l’intérieur de l’organisme intact, partiellement translucide. Troisièmement, les muscles peuvent être étudiées dans leur environnement naturel, où ils sont connectés à l’exosquelette formant par l’intermédiaire de cellules de tendon et tension des tissus est construite. Ce n’est pas possible dans les systèmes de culture des cellules musculaires. Et enfin, il existe une pléthore d’outils génétiques chez la drosophile. Parmi ceux-ci figurent plusieurs marqueurs fluorescent étiquetés permettant l’étiquetage des types spécifiques de cellules ou structures subcellulaires d’imagerie in vivo.
Le tableau 1 résume les principaux marqueurs utilisés pour l’étude de la morphogénèse de muscle-tendon. Il comprend les marqueurs surexprimés utilisant le système GAL4-UAS1 et endogène tag protéines marqueurs2,3,4. L’avantage du GAL4-UAS-système est que les marqueurs sont généralement exprimés à des niveaux élevés, ayant pour résultat un signal fort qui peut facilement être photographié en entier-Montez pupes. En outre, spécificité tissulaire est possible en choisissant soigneusement les pilotes GAL4. L’avantage des protéines de fusion exprimés sous contrôle endogène est que la dynamique des protéines respectifs peut être étudiés en vivo, elles aussi peuvent être utilisés comme marqueurs pour différents types de cellules ou structures subcellulaires spécifiques, par exemple, ΒPS-intégrine-GFP pour sites d’attachement musculaires. Ensemble, ces marqueurs offrent une grande flexibilité dans la conception expérimentale et le choix des problèmes de recherche qui peut être résolu maintenant et dans l’avenir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Structure de l’étiquette</td>
			<td colspan="2">Marqueur</td>
			<td colspan="2">Expression et localisation</td>
			<td colspan="2">Classe</td>
			<td colspan="2">Numéro de stock</td>
			<td colspan="2">Commentaire</td>
			<td>Réf.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Muscle</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">tous les myoblastes et tous les muscles à tous les stades</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">précurseurs de muscle adulte et des myotubes début jusqu'à ≈24 h CSA</td>
			<td colspan="2">Ligne de GAL4, piège d’enhancer</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">sauter le muscle à la différenciation</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">Enhancer Act88F / promoteur conduite Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Ca2 + indicateur</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">muscles de vol indirect à partir de ≈14 h CSA</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 et fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Lui- nls-GFP</td>
			<td colspan="2">précurseurs de muscle adulte, nucléaires, jusqu'à ≈24 h CSA dans les muscles de vol indirect</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promoteur avec journaliste nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">fragment de renforceur de 1,5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules dans les modèles de DLM et pour différencier les muscles</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promoteur avec journaliste Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules dans les myotubes (par exemple dans les muscles du vol indirect de h ≈14 AFP, diminuant fortement après ≈48 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomères (filament épais) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-piège</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Utilisez hétérozygote, un sous-ensemble de l’isoforme des étiquettes</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomères (Z-disque) dans tous les muscles du corps (par exemple dans les muscles de vol indirect à partir de ≈30 h CSA)</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, utilisation hétérozygote</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disque dans tous les muscles du corps</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disque dans tous les muscles du corps</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine ; exprimée dans l’épithélium, les myoblastes et les myotubes</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">jonctions de cellules épithéliales, les myoblastes et les membranes dans les muscles à tous les stades</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Site d’attachement de muscle</td>
			<td colspan="2">ΒPS-intégrine-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-knock-in</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP et mCherry-</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne MiMIC)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (mouche TransgeneOme ligne)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ILK-GFP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-trap (ligne FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP et - DP</td>
			<td colspan="2">sites d’attachement (p. ex., départ ≈18 h AFP dans les muscles de vol indirect) de muscle.</td>
			<td colspan="2">GFP-fusion (transgène)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendon</td>
			<td colspan="2">
SR-GAL4</td>
			<td colspan="2">cellules de tendon de thorax, tout au long de la chrysalide</td>
			<td colspan="2">Ligne de GAL4, piège d’enhancer</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozygotes létale</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Musculaires et tendineuses</td>
			<td colspan="2">
DUF-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscles et épithéliums, précoce</td>
			<td colspan="2">GAL4 ligne</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">kirre-rP298, marqueur de cellules fondateur</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">SAMU-reporters</td>
			<td colspan="2">
SAMU- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">domaine de liaison de l’actine de la moésine fusionnée à la GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA fusionnée à mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">liaison de l’actine</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">divers stocks, par exemple : BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 27391 et 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
SAMU-palm-mCherry</td>
			<td colspan="2">liaison de la membrane par l’intermédiaire de palmitoylation</td>
			<td colspan="2">Ligne de SAMU</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
SAMU- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Tag fluorescent marqueurs protéiques pour l’étude muscle-tendon morphogenèse in vivo.
Ici, nous décrivons en détail comment l’imagerie de la morphogénèse du muscle-tendon en nymphes vivantes peut être effectuée facilement et avec succès (Figure 1). Alternativement, les pupes peuvent être fixés, disséqué et immunomarquage, qui permet en utilisant des anticorps d’également étiqueter les protéines pour lesquelles aucun vivre marqueurs sont disponibles22. Dans ce cas, la qualité d’image est généralement plus élevée, car il n’y a pas de mouvement et la structure d’intérêt peut être placée à proximité immédiate de la lamelle. Cependant, dissection et fixation peuvent mener aux dommages et moléculaire ou dynamique du tissu, par exemple, musculaires, ne peut être étudiée dans l’organisme vivant.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>product has been replaced by Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fly food in bottles (or vials)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>standard culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brush</td>
			<td>da Vinci</td>
			<td>1526Y</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VWR: 631-1303</td>
			<td>76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape (optional)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6651263</td>
			<td>12 mm x 6.3 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632102</td>
			<td>94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper tissues</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7695251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>straight tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic slides with a groove (reusable)</td>
			<td>custom-built</td>
			<td>-</td>
			<td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107032</td>
			<td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49781</td>
			<td>dilute to 50 % in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adhesive tape</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>57370-02</td>
			<td>1.5 mm x 10 m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Ainsi que les tendons et le squelette, les muscles aux animaux dont les humains pour déplacer leurs parties du corps. Morphogenèse de muscle est hautement conservée des animaux aux humains. Par conséquent, le puissant système de modèle drosophile permet d’étudier les concepts du développement de muscle-tendon qui peut également être appliquée à la biologie du muscle humain. Ici, nous décrivons en détail comment la morphogénèse du système tendon-muscle adulte peut être facilement photographiée sur la vie, développer des pupes de drosophile . Donc, la méthode permet d’enquêter sur les protéines, les cellules et les tissus dans leur environnement physiologique. Outre un protocole étape par étape avec des conseils utiles, nous donnent un aperçu complet des protéines de marqueur fluorescent étiqueté qui conviennent pour l’étude du système tendon-muscle. Pour mettre en évidence les multiples applications du protocole, nous montrer des films exemple allant de visualisation d’événements morphogénétiques à long terme – qui se produisent à l’échelle de temps des heures et des jours – à la visualisation des manoeuvres dynamiques comme les contractions musculaires qui se produisent sur une échelle de temps de secondes. Globalement, ce protocole devrait permettre au lecteur de concevoir et de réaliser des expériences d’imagerie live pour enquêter sur la morphogenèse muscle-tendon dans l’organisme intact.

Divers tissus peuvent être imagé in vivo dans le développement des mouches nymphes, ce qui les rend un système modèle idéal pour étudier la morphogenèse des organes adultes. Parmi ceux-ci sont les muscles de vol indirect, l’épithélium de thorax, y compris les cellules de tendon, l’épithélium de l’aile, muscles abdominaux et le coeur22,23,24,25,26 , 27. ici, nous nous concentrons sur l’imagerie Webcam live de la morphogénèse musculaires et tendineuses. Pour une description détaillée des muscles de vol indirect et morphogenèse des muscles abdominaux et des méthodes supplémentaires pour étudier la biologie du muscle chez la drosophile, nous renvoyons le lecteur à Weitkunat et Schnorrer 201422.
Vivre d’imagerie des muscles de vol indirect
Pour étudier le développement à long terme des muscles du vol indirect comprenant les muscles dorsolongitudinaux (DLMs) et les muscles dorsoventral (DVMs), globulaire moésine domaine de liaison de l’actine tag avec GFP (SAMU -GFP-Gma) a été exprimé dans tous les muscles en utilisant le facteur de renforceur de Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 pilote (Figure 2 a-D, Film S1). Avant l’imagerie, une fenêtre dans la pupe a été ouverte au-dessus de la cage thoracique, comme sur la Figure 1F. Sur un microscope biphotonique, z-cheminées ont été acquis toutes les 20 min de 21 h à partir de ≈11 h après formation puparium (11 h CSA). Dans ce laps de temps, les DLMs (vert superpositions en Figure 2 a'-D') tout d’abord ouvrir la pièce jointe aux cellules tendineux (Figure 2 a) et ensuite divisé alors que les attaches musculaires matures (Figure 2 b). Ensuite, les myotubes raccourcir (Figure 2) jusqu'à ce qu’ils atteignent enfin la scène compactée au maximum à 30 h CSA (Figure 2D). Pris ensemble, ce film met en lumière des bouleversements dans la morphologie du muscle qui se produisent à l’échelle de temps d’heures.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Figure 2 : imagerie de la morphogénèse musculaires et tendineuses de vol indirect en direct. (A-D) Fois points d’un film de deux photons (film S1) à l’aide de Mef2-GAL4, SAMU- GFP-Gma comme marqueur pour l’actine dans les muscles de vol indirect consistant en les muscles dorsolongitudinaux (DLMs, surlignés en vert a "-D") et les muscles dorsoventral ( DVMs, surlignés en bleu a "-D"). Barreaux de l’échelle est de 100 µm. (E-H) moments d’un film de deux photons (film S2) à l’aide de Duf-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur des muscles du vol indirect et l’épithélium du thorax dont les cellules du tendon. Panneaux E'-H' afficher une incrustation avec un modèle du système tendon-muscle à chaque moment, mettant en évidence les extensions longues cellulaires formée par l’épithélium du tendon (magenta) en contact avec les muscles (vert). Barreaux de l’échelle est de 100 µm (estimée à partir des dimensions des structures de représentation). (J’ai-L) Fois les points d’un film confocal bicolore, tourne disque (film S3) mettant l’accent sur l’initiation de muscle-tendon accessoire. Les cellules de tendon sont étiquetés avec sr-GAL4SAMU-palm-mCherry (magenta) et le dorsolongitudinaux indirecte vol muscles avec Mhc -Tau-GFP (en vert). Barreaux de l’échelle est de 10 µm. le temps est indiqué comme hh : mm après formation puparium (APF). Notez que pas tous les films ont été acquis sur une étape de contrôle de la température, par conséquent, le calendrier du développement peut-être diverger. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour l’étude de morphogenèse tendon et le muscle en même temps, liée à la membrane GFP (SAMU -CD8-GFP) a été exprimé en Dumbfounded (Duf)-GAL4 comme chauffeur, qui s’exprime aussi bien dans les cellules des tendons et des muscles de vol indirect (Figure 2E -H, film S2). Une z-pile a été prise sur un microscope biphotonique toutes les 20 min à partir de 16 h CSA pour 20 h. Alors que les myotubes compact (overlay vert dans la Figure 2E'-H'), le tendon de cellules forme extensions longues cellulaire qui s’allongent avec le temps (magenta superposition dans Figure 2E'-H'). Pris ensemble, ce film met en lumière l’étroite interaction entre le tendon et le muscle cellules in vivo.
Pour étudier l’interaction des muscle-tendon plus en détail, deux couleurs, fort grossissement imagerie a été réalisée. Nymphes avec chaîne lourde de myosine (Mhc)-Tau-GFP dans la DLMs et SAMU -palmitoylées-mCherry (SAMU -palm-mCherry), conduit par stripe (sr)-GAL4 dans les tendons ont été photographié toutes les 5 min à partir de 12 h CSA pendant 4,5 heures sur un disque de rotation microscope confocal (Figure 2I-L, film S3). A 12 h CSA, les myotubes migrent vers leurs cellules cibles de tendon tout en formant de longs filopodes à leur extrémité (Figure 2I). Par la suite, les muscle et le tendon tissus pavimenteuses (Figure 2J, K) pour former une fixation stable. Avec la maturation de la pièce jointe, moins filopodes forme et l’interface de tendon-muscle lisse (Figure 2 L). Ainsi, l’imagerie bicolore, fort grossissement peut être utilisé pour révéler la dynamique cellulaire en détail dans l’organisme vivant.
Vivre la formation image des muscles abdominaux
Pour l’imagerie direct des muscles abdominaux (Figure 3film S4), Mef2-GAL4> SAMU-CD8-GFP a été utilisé comme un marqueur et une fenêtre a été ouverte au-dessus de l’abdomen dans la pupe comme indiqué dans la Figure 1. Comme dans le film de muscles de vol indirect représenté dans la Figure 2 a-D, la formation et la croissance des muscles abdominaux peuvent être suivis au cours de nombreuses heures de développement (h 55 dans film S4). Pendant ce temps, les myoblastes fusionnent pour former de plus en plus les myotubes (Figure 3 a). Les conseils de myotubes migrent vers leurs cibles de tendon, et après avoir branché sur les cellules de tendon, sont forment les unités contractiles des muscles, les sarcomères, (Figure 3 b-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Figure 3 : vivre l’imagerie de la morphogénèse des muscles abdominaux. (A-D) Fois les points d’un film (film S4) à l’aide de Mef2-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur pour suivre la morphogenèse des muscles abdominaux. Panneaux A'-E' afficher les superpositions avec les modèles d’un ensemble de muscles abdominaux (vert) qui se forme en reprenant le stade pupal. Barreaux de l’échelle est de 100 µm. le temps est indiqué comme hh : mm CSA. Le film a été acquis à la température ambiante. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Vivre d’imagerie des contractions des muscles
Contrairement à la Figure 2 et Figure 3, Figure 4 montre la dynamique musculaire survenant à l’échelle de temps de secondes : l’enregistrement live de contractions musculaires. Nymphes exprimant βPS-intégrine-GFP sous contrôle endogène ont été photographiés avec une résolution temporelle de 0,65 s dans un seul plan z sur un microscope confocal (Film S5). Dans l’exemple illustré à la Figure 4, les sites de fixation de trois DVMs (Figure 4 a) ont été projetés pendant 10 min à partir de 42 h CSA. Pendant ce temps, contraction de cinq événements ont été observés (Figure 4 b-F), montrant que les sarcomères sont déjà assemblés assez bien pour soutenir les contractions coordonnées à ce point dans le temps dans le développement. Par conséquent, imagerie des contractions musculaires peut servir une lecture fonctionnelle pour sarcomerogenesis déjà pendant le développement musculaire vol indirect28, par opposition à par exemple essais en vol, qui ne peut être effectuée qu’après l’éclosion.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Figure 4 : imagerie des contractions des muscles en direct. (A) tout d’abord-point dans le temps d’un film (film S5) montrant les contractions des muscles de vol indirect dorsoventral à 42 h CSA en utilisant βPS-intégrine-GFP comme marqueur. Dans le champ de vision est le muscle sites d’attachement de DVM II 2, DVM III 1 et DVM III 2. (B-F) La couleur des superpositions de cinq épreuves individuelles de secousse, chacun montrant le cadre avant la secousse (magenta) et la première image de l’événement de la secousse (vert). Notez que les fibres musculaires individuels se contracter indépendamment les uns des autres. Flèches mettent en évidence le mouvement de contractions. La résolution temporelle du film est de 0,65 s. barres d’échelle sont 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Imagerie des protéines étiquetées de manière endogène en direct
Semblable à βPS-intégrine-GFP, une grande collection de protéines de fusion exprimés chez la drosophile sous contrôle endogène a été généré2,3,4. Ces lignes de mouche peuvent être utilisés pour étudier par exemple la localisation subcellulaire ou les profils d’expression des protéines d’intérêt. La collection est particulièrement utile si les anticorps spécifiques ne sont pas disponibles ou la dynamique des protéines doit être étudiés en vivo sans fixation. La figure 5 illustre trois exemples des protéines de fusion exprimée de façon endogène de la mouche TransgeneOme (fTRG) bibliothèque, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figure 5 a, B), Talin-GFP (Figure 5, D) et βTubulin60D-GFP ( Figure 5E, F). L’expression de ces protéines peut être étudiée dans tous les tissus qui les expriment naturellement. Ici, nous montrons l’épithélium du thorax (Figure 5 aC, E) et les muscles du vol indirect ou leurs sites de fixation (Figure 5 bD, F) comme exemples.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Figure 5 : imagerie Live de façon endogène tag protéines. (A, B) Maximums de prises des pupes exprimant Hts-GFP de z-cheminées. (C, D) Maximums de prises des pupes exprimant Talin-GFP de z-cheminées. (E, F) Maximums de prises des pupes exprimant βTubulin60D-GFP de z-cheminées. Panneaux A, C E montrent l’épithélium du thorax à 18, 24 et 18 h CSA, respectivement et panneaux B, D et F montrent les muscles de vol indirect ou leurs sites de fixation à 30 h CSA. Barreaux de l’échelle est 25 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K vues.  Max Planck Institute of Biochemistry. Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .

Vidéo: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Recherche

Biologie du développement

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imagerie de calcium dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Activation à Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...