Intrathorakische Injektion für die Erforschung des erwachsenen Zebrafischherz

In der Herzforschung an erwachsenen Zebrafischen werden medikamentöse Behandlungen in der Regel systemisch durchgeführt. Mit intrathorakaler Injektion kann man lokal eine Lösung für das Herz liefern, ohne Myokardschäden zu verursachen. Diese Methode ermöglicht die Lieferung von kleinen Mengen von Medikamenten, Proteinen oder anderen Molekülen in Lösung genau um das Herz eines erwachsenen Zebrafisches.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Nadelzieher, um mikroinjectionangepasste Borosilikatglaskapillaren zu ziehen. Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren in einer neun Zentimeter langen Petrischale mit Schienen aus Modellton oder Klebeband auf. Schneiden Sie mit einer gewöhnlichen Schere ein Stück Schwamm und schnitzen Sie eine fischartige Silhouette in der Mitte.

Als nächstes bereiten Sie kleine Aliquots der Injektionslösungen mit den getesteten Proteinen oder anderen Verbindungen vor. Passen Sie ihre Konzentration in Abhängigkeit vom Test an, indem Sie die Substanz in 1x Hanks'ausgewogene Salzlösung verdünnen, die mit 10% Phenolrot ergänzt wird. Um die Arbeitskonzentration von Anästhetika zu erhalten, fügen Sie zwei bis drei Milliliter Tricain-Stammlösung zu einem Becher hinzu, der 100 Milliliter Fischwasser enthält.

Schalten Sie zunächst das Stereomikroskop mit dem Licht von oben ein, und stellen Sie die Vergrößerung auf das 16-fache ein. Den Schwamm mit Fischwasser einweichen und auf eine neun Zentimeter lange Petrischale auf dem Mikroskop legen. Passen Sie den Fokus an, und verwenden Sie unter dem Stereomikroskop eine Iridektomieschere, um das Ende einer Mikrokapillare etwa sieben Millimeter von der Basis zu schneiden, wie in Abbildung 1A des Textprotokolls beschrieben.

Setzen Sie die geschnittene Mikrokapillare in den Nadelhalter des Mikroinjektorgeräts ein. Laden Sie mit den Microloader-Spitzen eine Steuerungslösung, um den Einspritzdruck einzurichten, um den entsprechenden Durchfluss zu erhalten, und entleeren Sie dann die Nadel. Danach laden Sie das ausgewählte Volumen der Injektionslösung in die Spitze der Kapillare, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Verwenden Sie ein Netz, um einen erwachsenen Fisch zu fangen, und übertragen Sie ihn in die Anästhetikumlösung. Nach ein bis zwei Minuten, wenn der Fisch aufhört zu schwimmen und die Bewegung von Operculum reduziert wird, berühren Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel, um sicherzustellen, dass er nicht auf irgendeinen Kontakt reagiert. Als nächstes, schnell und vorsichtig übertragen Sie die Fische in die Nut des nassen Schwamms, mit der ventralen Seite nach oben.

Der Kopf des Fisches sollte von der dominanten Hand des Bedieners wegzeigen. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop sorgfältig die Bewegung des schlagenden Herzens unter der Haut der Fische. Bestimmen Sie visuell den Injektionspunkt über dem schlagenden Herzen und in der Mitte des Dreiecks, definiert durch die ventralen Knorpelplatten.

Setzen Sie die Spitze der Kapillare in einem Winkel zwischen 30 und 45 Grad relativ zur Körperachse ein. Durchdringen Sie die Haut mit der Spitze der Mikrokapillare vorsichtig in das Perikard. Sobald sich die Nadel im Perikard befindet, drücken Sie das Pedal des Mikroinjektors, um die Injektion abzuschließen.

Nach der Injektion die Kapillare vorsichtig aus dem Thorax ziehen und den Fisch sofort in einen Tank mit Systemwasser zur Rückgewinnung geben. Überwachen Sie die Fische bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie. Um die Auswirkungen der Injektion zu analysieren, sammeln Sie das Herz zum gewünschten Zeitpunkt und bereiten Sie es für die weitere Analyse vor.

In dieser Studie werden exogene Verbindungen und Proteine in die Perikardhöhle geliefert, um deren Wirkung auf das Herz bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen. Um diese Methode zu validieren, werden zwei Testexperimente durchgeführt, indem Farb- und Fluoreszenzfarbstoffe in eingeschläferte Fische injiziert werden. In beiden Assays zeigt die Gesamtanalyse die Kennzeichnung des gesamten Herzens einschließlich der Herzkammer, des Atriums und des Bulbus arteriosus.

Diese Ergebnisse zeigen eine effiziente Streuung der Injektionslösungen auf der Herzoberfläche. Um die Eignung der intrathorakalen Injektion mit der intraperitonealen Injektion für Herzstudien zu vergleichen, wird eine ähnliche Menge an DAPI mit beiden Methoden injiziert. Die Herzen werden dann entweder nach fünf Minuten oder nach 120 Minuten fixiert.

Keine DAPI-positiven Zellen werden in den Herzen nach intraperitonealer Injektion zu einem der beiden Zeitpunkte beobachtet. Im Gegensatz dazu führen die intrathorakalen Injektionen zum Vorhandensein von DAPI-markierten Kernen im Myokard. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrathorakale Injektion die Abgabe der Verbindung an das Herz verbessert, im Vergleich zur intraperitonealen Injektion.

Um die Eignung dieser Methode für Herzregenerationsstudien zu testen, ventrikeln kryoinjured, und dann Injektionen werden an drei und sieben Tagen nach der Kryoverletzung durchgeführt. Sowohl das Myokard als auch das verletzte Gewebe enthalten zahlreiche DAPI-positive Zellen, was auf ein effizientes Eindringen dieses Farbstoffs in das intakte Herz und das fibrotische Gewebe hindeutet. Darüber hinaus wird injiziertes Phalloidin AF649 auch durch Kardiomyozyten der Peri-Verletzungszone und einige rekrutierte Fibroblasten des verwundeten Bereichs aufgenommen.

Dieses Experiment zeigt, dass die Medikamente das Epikard kreuzen und in das zugrunde liegende Myokard eindringen können. Nach dem Testen der Effizienz der intrathorakalen Injektionen mit Farbstoffen werden die Auswirkungen von Proteinen, die auf das Herz injiziert werden, analysiert. Dazu werden die Auswirkungen des exogenen Zytokins auf verschiedene Prozesse untersucht.

Die biologischen Aspekte der Kardiomyozytenproliferation, extrazelluläre Matrixabscheidung, Immunzellrekrutierung und kardioprotektive Genexpression werden durch intrathorakale Injektion von Zytokin aktiviert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrathorakale Injektion eine geeignete Strategie für die gezielte Abgabe von Proteinen bietet, um deren Auswirkungen auf verschiedene Herzgewebe in einer Vielzahl von Assays zu untersuchen. Das Einsetzen der Nadel in das Perikard ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche Injektion.

Die Form der Nadel, der Eindringwinkel und die Punktionsstellen sind faktoren, die das Einführen der Nadel beeinflussen. Nach oder vor der intrathorakalen Injektion kann man Kryoverletzungen durchführen, um die Wirkung der injizierten Moleküle auf die Herzregeneration zu analysieren. Intrathorakale Injektion wurde bei Zebrafischen verwendet, um die Herzvorbedingung zu studieren.

Ein Protein namens CNTF wurde injiziert und hat gezeigt, zytoprotektive und pro-regenerative Programme im Herzen zu verbessern.