Lo scopo del metodo è quello di generare una sinapsi immunologica che è un esempio di coniugazione cellula-cellula formata da una cellula che presenta antigene e da un linfocita di aiuto t. Il nostro obiettivo è registrare le prime fasi della formazione della sinapsi immunitaria e registrare gli eventi di traffico che si verificano nel linfocita T-helper. Questi alla fine porteranno alla secrezione polarizzata alla sinapsi immunitaria.
L'approccio qui presentato prevede coniugazione da cellula a cellula, acquisizione time-lapse, microscopia a fluorescenza a campo largo e successiva elaborazione delle immagini. Ciò migliora il rapporto segnale-rumore delle immagini, migliora la risoluzione temporale e consente l'acquisizione simultanea di diversi fluorocromi nei coniugati sinaptici emergenti e diminuisce lo sbiancamento della fluorescenza. Inoltre, il protocollo è compatibile con i protocolli di fissazione delle cellule del punto finale che consentiranno la colorazione e l'analisi dell'immunofluorescenza.
Questo protocollo è anche compatibile con la microscopia fluorescente a scansione laser e altre tecniche di microscopia all'avanguardia. A dimostrare la procedura saranno Ana Bello, una studentessa laureata, Alejandro Garrido, un tecnico, e Solange Moreno, una studentessa laureata. Per iniziare questa procedura, aggiungere 150 microlitri di fibronectina a ciascun pozzo di uno scivolo a camera a otto microwell e incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora.
Dopo il periodo di incubazione, aspirare la fibronectina e lavarsi ogni bene con 200 microlitri di PVS per due minuti con delicato scuotimento. Ripetere ancora una volta questo lavaggio e lasciare il secondo lavaggio nel pozzo. Trasferire 10 millilitri di una precoltura confluente di cellule Raji in un tubo a V-bottom da 15 millilitri.
Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet cellulare in mezzo caldo e completo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Per etichettare le cellule Raji, trasferire il numero richiesto di cellule nel mezzo di coltura in un tubo a due millilitri.
Per lo scivolo a camera a otto microwell, è necessario un totale di 1,6 millilitri di sospensione cellulare. Aggiungere il localizzatore di celle blu a una concentrazione finale di 10 micromolari. Rimospendare le celle macchiate di blu del localizzatore di cellule e trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo delle diapositive a camera rivestite di fibronectina preparate.
Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per 30 minuti o un'ora. Successivamente, agitare delicatamente le diapositive della camera al microscopio per assicurarsi che le cellule Raji siano rispettate. Lavare bene ciascuno con cura con un mezzo di coltura cellulare caldo e completo per eliminare il blu del tracker di cellule in eccesso.
Assicurarsi che le cellule Raji siano rispettate sul fondo delle piastre e mostrano spazi tra loro e non sono confluenti. Il 50-60% della confluenza cellulare è appropriato. In primo luogo, aggiungere l'enterotossina E stafilococco ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro ad ogni pozzo.
Assicurarsi che le cellule Raji siano pulsate con superantigeno altrimenti il recettore delle cellule T delle cellule Jurkat non riconoscerà l'SCE e la sinapsi non si formerà. Incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per almeno 30 minuti. Successivamente, ottenere una coltura precedentemente in crescita di cellule di Jurkat ad una concentrazione compresa tra 1 e 2 milioni di cellule per millimetro.
Osservare le cellule al microscopio a contrasto di fase e quindi trasferire le cellule in un tubo con fondo a V da 15 millilitri. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in un mezzo di coltura caldo e completo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.
Quindi mantenere le cellule di Jurkat in coltura a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica fino a quando non sono pronte per l'uso. Recuperate le diapositive della camera contenenti le cellule Raji con etichetta blu Staphylococcus Enterotoxin E dall'incubatrice. Aspirare con cura il mezzo di coltura da ogni pozzo uno per uno con una pipetta posta in un angolo del pozzo.
Sostituire immediatamente il mezzo con 200 microlitri delle cellule di Jurkat rimorsiate nel mezzo di coltura cellulare. Se viene eseguito un time lapse, procedere rapidamente al microscopio. Individuare la diapositiva a camera sul cameriere di staging al microscopio e selezionare alcuni campi appropriati.
Preparare il microscopio e la camera di incubazione prima dell'imaging. Dopo che le cellule di Jurkat sono state aggiunte a ciascun pozzo contenente le cellule Raji, individuare rapidamente lo scivolo della camera microwelled sull'incubatore a fasi del microscopio preriscaldato e selezionare alcune posizioni XY. Se è previsto solo un esperimento endpoint, incubare lo scivolo della camera a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del cinque per cento per una o due ore.
Dopo il periodo delle impostazioni cultura, verificare la formazione coniugata e successivamente correggere i coniugati come delineato nel protocollo di testo. Per fissare le cellule, aggiungere RPMI caldo senza FCS e agitare delicatamente. Aspirare l'RMPI e aggiungere 200 microlitri di PFA o acetone prechilled ad ogni pozzo.
Incubare lo scivolo della camera a temperatura ambiente o sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi lavare ogni bene due volte con PVS e aggiungere 200 microlitri di soluzione di tempra. In questo studio, vengono generati coniugati di sinapsi immunitaria Jurkat-Raji e le prime fasi della formazione di sinapsi immunologica sono correttamente immagini.
Questa strategia induce la formazione di sinapsi immunologica eseguendo contemporaneamente l'imaging time lapse. Qui sono mostrati i coniugati sinaptici rappresentativi Jurkat-Raji ottenuti da questa tecnica, tra cui un'immagine del canale di trasmittanza, il canale blu del localizzatore di celle ed entrambi questi canali uniti. Si possono vedere alcuni coniugati sinaptici, inclusi quelli fatti di una sola cellula di Jurkat e diverse cellule Raji, che sono coniugati complessi.
La diminuzione delle concentrazioni cellulari eluderà la formazione di coniugati cellulari complessi, ma potrebbe non fornire abbastanza coniugati cellulari per la successiva analisi del traffico polarizzato, che a sua volta ridurrà le possibilità di trovare e di individuare coniugati sinaptici emergenti. Una deconvoluzione delle immagini del canale di fluorescenza GFP-CD63 viene eseguita con un software di deconvoluzione appropriato utilizzando l'opzione ottica wide field e i parametri ottici appropriati. Questo canale deconvoluto è stato successivamente fuso al canale largo blu del localizzatore di celle.
Vi è un miglioramento sia del rapporto segnale-rumore che della nitidezza. Qui viene mostrata una pila Z rappresentativa di un coniugato fisso di sinapsi immunologica. L'immunofluorescenza viene eseguita usando la phalloidina per visualizzare l'F-actina, l'anti-CD63 per visualizzare l'MVB e l'anti-gamma-tubulina per visualizzare l'MTOC mentre il localizzatore di cellule blu etichettava le cellule Raji.
Il trasfisso opzionale delle celle di Jurkat consentirà la visualizzazione del traffico dei granuli secretori nelle cellule viventi. Ad esempio, quando viene espresso GFP-CD63, è possibile registrare il movimento delle vescicole decorate con GFP-CD63. Il protocollo è compatibile con i protocolli di fissazione del punto finale che consentiranno ulteriori protocolli e analisi di colorazione dell'immunofluorescenza.
Esistono modelli sperimentali di produttività che possono semplificare l'imaging nella sinapsi immunitaria, ma questi modelli non emulano la superficie complessa e irregolare sulle cellule antigene-presentatore che possono produrre interazioni non fisiologiche alla sinapsi immunitaria. L'approccio qui descritto è adatto a riprodurre e confermare alcune complessità biologiche che si verificano alla sinapsi immunitaria. Superantigen è una tossina pericolosa, quindi assicurati di indossare i guanti e lascia cadere la punta usata sulla scatola pericolosa.
