Name: Video: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00
Duration: 10 min
Description: 77.9K Views. Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine. Qui illustriamo il protocollo per l'imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine sinaptiche e il citoscheletro.

Ringraziamo Geoff Daniels per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla R01 AI067946 a JSO

1. Coprivetrini cappotto con anticorpi <ol><li> Preriscaldare (a 37 ° C) 30 ml di RPMI 10% FCS e supporto 1 ml di BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Preparare una soluzione di 5 pg / ml di anticorpo purificato in tampone fosfato (PBS). Per l&#39;attivazione della linea cellulare NK92, uso di anti-CD18 e anti-NKp30 è raccomandato. <ol><li> Mark cerchio di dimensioni di circa un centesimo per ogni condizione su un # 1.5 vetrino con una penna PAP. Per un esperimento di due colori, non ci dovrebbero essere quattro condizioni: senza macchia, doppio macchiati, e due condizioni colorate singoli. Pipettare 200 ml di soluzione di anticorpi in ogni regione e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare coprioggetto immergendo delicatamente ciascuno in 50 ml di PBS in una provetta conica da 50 ml a temperatura ambiente. Lavaggio deve avvenire immediatamente prima l&#39;aggiunta di cellule e cura devono essere prese per evitare di anticorpi essiccazione sul vetrino. </li></ol></li></ol> 2. Attivare le cellule NK di coperturascivola, Fix e permeabilize <ol><li> Isolare 5 x 10 5 NK92 cellule per condizione. Centrifuga e decantare il surnatante. Lavare una volta con 10 ml di media preriscaldata dal punto 1.1. Centrifuga e decantare il surnatante. <ol><li> Risospendere le cellule in mezzi preriscaldate dal punto 1.1 a una concentrazione di 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Decantare lentamente 200 ml al centro della regione creata al punto 1.2.1. Incubare a 37 ° C per 20 min a 5% di CO 2. (Nota: questo tempo può essere prolungato o ridotto a seconda della funzione biologica di interesse per NK granello cella di polarizzazione, 20 min è sufficiente.). </li></ol></li><li> Dopo l&#39;incubazione delle cellule, lavi delicatamente coprioggetto immergendo ciascuna in 50 ml di PBS a temperatura ambiente in una provetta da 50 ml. </li><li> Aggiungere 1 l di Triton X-100 a 1 ml di soluzione preriscaldata Fix / Perm dal punto 1.1 e vortice accuratamente. Fix e permeabilize aggiungendo 200 ml di tampone Fix / Perm (fase 2.3) alle cellule. Incubare per 10 min al buio a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Celle Stain <ol><li> Preparare colorazione buffer: tampone fosfato (PBS), 1% BSA, 0,1% saponina. <ol><li> Preparare la soluzione di anticorpo primario in 200 ml buffer di colorazione (vedi punto 3.1). (Nota: l&#39;anticorpo deve essere titolata prima dell&#39;uso). Evitare l&#39;uso di anticorpo primario che viene generato nella stessa specie utilizzate per rivestire il vetrino (punto 1.2). Anche evitare collegamenti Strepatividin-biotina per l&#39;imaging STED. </li><li> Dopo sezione 2.3.1, lavare delicatamente vetrini in 50 ml di colorazione buffer. Tamponare bordi della PAP-pen regione con un batuffolo di cotone per rimuovere il tampone in eccesso. Applicare la soluzione di anticorpo creato nella sezione 3.1.1. Incubare 30 minuti al buio a temperatura ambiente. (Consigliato: incubare vetrini in casella diapositiva con un tovagliolo di carta umido per mantenere l&#39;umidità). </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di anticorpo secondario 200 ml Colorazionebuffer. Fluorofori consigliate sono Alexa Fluor 488, Pacific Orange, e V500. Generalmente, una diluizione 1:200 è adatto per l&#39;imaging STED. <ol><li> Lavare delicatamente vetrini in 50 ml di colorazione buffer. Tamponare bordi della PAP-pen regione con un batuffolo di cotone per rimuovere il tampone in eccesso. Applicare la soluzione anticorpo secondario. Incubare 30 minuti al buio a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Ripetere il lavaggio e colorazione per le proteine ​​di interesse aggiuntivi. Se rilevando F-actina con falloidina, questo può essere inclusa con anticorpo secondario, generalmente ad una diluizione 1:200. </li></ol> 4. Mount Coprivetrini su diapositive <ol><li> Preparare mezzo di montaggio. Nota: Prolungare o prolungare oro sono preferibili. Vectashield deve essere evitata, in quanto non è compatibile con STED. 2,2-thiodioethanol deve essere evitata se si utilizza falloidina. Mowiol è accettabile. </li><li> Mettere a circa 10-20 ml di mezzo di montaggio in una diapositiva. Inverti coprioggetto (cellulare rivolto verso il basso) e montare coprioggetto delicatamente, avendo cura dievitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria. Incubare i vetrini per 24 ore (fino coprioggetto) prima di imaging. </li><li> Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto. </li></ol> 5. Setup sperimentale <ol><li> Avviare laser e software necessari. Avviare STED laser esaurimento al 100% di potenza. Allineare STED laser, che nel caso di sistemi commerciali è spesso una procedura automatizzata. </li><li> Mettere a fuoco il campione, a cominciare con il controllo macchiato singolo, il microscopio usando oculari. </li></ol> 6. Ottimizzazione delle impostazioni <ol><li> Eseguire la scansione del primo canale e ottimizzare la potenza del laser, la posizione del fascio di eccitazione e la gamma del rivelatore. Se possibile, evitare un guadagno di&gt; 100. Catturare l&#39;immagine confocale per ottimizzare le impostazioni. Line e / o telaio media aumenterà risoluzione. Verificare la saturazione dei pixel. Nota: Alcuni saturazione è accettabile in confocale come applicazione di STED ridurrà l&#39;intensità di emissione. Per STED, una dimensione ottimale dei pixel sarà inferiore a 30 nm comesempre migliore risoluzione viene ottenuta con dimensioni di pixel più piccole. La dimensione della regione di interesse viene esposta detterà il limite inferiore della dimensione dei pixel. Dimensioni dei pixel più piccoli possono aumentare photobleaching. <ol><li> Applicare un&#39;immagine di acquisizione STED fascio esaurimento e, iniziando con il 50% della potenza del laser esaurimento. Se un miglioramento della risoluzione è visto, più potenza laser esaurimento può essere applicata. In questa fase, può essere necessario regolare la potenza di eccitazione laser, media linea, e / o il guadagno. </li><li> Applicare tempo di controllo per ridurre sfondo (minimo 0,3 NSEC). Regolare le impostazioni finché un miglioramento della risoluzione rispetto confocale può essere visto. La risoluzione può essere approssimata stimando larghezza metà del massimo (FWHM). Essa rappresenta la distanza alla metà dell&#39;intensità massima di un picco gaussiano creato tracciando una linea di profilo attraverso la struttura di interesse, ed è un metodo ampiamente utilizzato per stimare risoluzione. </li><li> Una volta che il primo canale è soddisfacente, avviare una seconda sequenza per sésequenziali scansione. In generale, è meglio effettuare la scansione della lunghezza d&#39;onda più lunga fluoroforo prima. Ripetere passo 6.1 su secondo canale. </li></ol></li><li> Conferma la mancanza di sovrapposizione spettrale per l&#39;imaging controlli colorate singoli con entrambe le sequenze di scansione. Sovrapposizione spettrale lieve può essere corretto utilizzare le funzioni delle Nazioni Unite mescolando spettrali nel software, invece, va evitato, ove possibile. </li></ol> 7. Acquisizione Immagine <ol><li> Acquisire immagini. Per l&#39;imaging quantitativo, si consiglia di ottenere almeno 20 immagini / condizione. Il numero esatto, tuttavia, dovrebbe essere definito secondo la domanda sperimentale in concerto con un approccio statistico come calcolo della dimensione campionaria. Salvare esperimento. </li></ol> 8. Deconvoluzione <ol><li> Apri il file con il software di deconvoluzione o il processore batch. Controllare i parametri per ciascun canale utilizzando il software. Conferma di eccitazione e di emissione spettri di ciascun canale, STED emissione di esaurimento, e di imaging direzionezione (su o giù, se l&#39;immagine è 3-dimensionale) in particolare. </li><li> Deconvolve utilizzando la procedura guidata deconvoluzione. Le impostazioni predefinite sono generalmente adeguate, tuttavia il segnale di rumore (SnTR) varierà da fluoroforo a fluoroforo e dovrà essere determinato per ogni canale e ogni esperimento singolarmente. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Costo pubblicazione parziale di questo articolo è stata ripartita da Leica Microsystems, Inc.

Il miglioramento della risoluzione rispetto confocale sarà piuttosto dipendente da fattori non controllabili. Questi fattori includono aberrazioni minori nella copertura dello spessore di slittamento e di incongruenze nel mezzo di montaggio. È importante mantenere la temperatura e l&#39;umidità nella camera di imaging più coerente possibile, e il fascio STED opportuno allinearla approssimativamente ogni 60 min. Come accennato in procedure, l&#39;uso di mezzo di montaggio Vectashield deve essere evitata, in quanto questo non è compatibile con STED. Inoltre che, si dovrebbe sempre utilizzare al # 1.5 vetrini e, se disponibile, utilizzare quelli che sono stati verificati ad uno spessore specifico. Una modifica del metodo qui descritto è di immagine canali supplementari confocale, utilizzando fluorofori che emettono alla lunghezza d&#39;onda più lunga del fascio STED. In questo modo, un&#39;immagine può fino a quattro canali (due in confocale, due in STED). Se questo approccio, tuttavia, i canali con fluorofori equella sede sopra il laser esaurimento STED dovrà essere ripreso prima, come applicazione del fascio STED esaurirà fotoni in questi canali. Un vantaggio di questa tecnica è l&#39;applicazione del tempo di controllo, che sarà anche migliorare la risoluzione in confocale eliminando emissione da fotoni con brevi vite 34. In particolare, l&#39;uso di gating tempo, i tempi di rivelatori di emissione per corrispondere con eccitazione impulsiva STED, diminuirà la fluorescenza di riflessione fuori dal vetro coprioggetto quando l&#39;imaging vicino ad esso. Anche in un esperimento non adatto per STED, se si utilizza una sorgente di eccitazione a impulsi, tempo di controllo può essere uno strumento utile per migliorare la risoluzione in confocale. Ci sono varie modifiche che possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione in STED. Uno è quello di ridurre le dimensioni del foro da 1 unità Airy standard, anche se questo sarà anche diminuire la quantità di luce che raggiunge il campione. Questo può essere compensata aumentando Laser potere o di guadagno. Un altro è quello di aumentare la media di linea, che consentirà di aumentare la quantità di informazioni raccolte per ogni fotone, migliorando la risoluzione. Ancora una volta, tuttavia, puo essere a costo di photobleaching del campione, così un saldo dovrà essere colpito tra risoluzione e sbianca. Analogamente, l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti come la GFP richiederà un&#39;attenta ottimizzazione per evitare sbianca. Ciò può essere ottenuto riducendo la potenza del laser STED se necessario. Punti di tempo più lunghi anche maggiore recupero di fotoni e ridurre lo sbiancamento. Correzione per fotodecolorazione deve essere contabilizzata quando si analizza dal vivo STED. Naturalmente, l&#39;imaging in 3 dimensioni in STED è anche possibile, e darà anche un miglioramento rispetto confocale convenzionale. Questo è particolarmente vero se è fatto in combinazione con deconvoluzione, anche se occorre prestare attenzione per correggere la deriva che si verifica durante l&#39;imaging piani multipli in z. Se si utilizza il software Huygensa deconvolve, questa correzione si ottiene utilizzando la funzione &quot;stabilizzare l&#39;immagine&quot;. Usando questo approccio, la risoluzione in z sarà migliorata. Questo è un grande miglioramento rispetto confocale convenzionale, che ha scarsa risoluzione assiale, e anche su sé solo STED, che ha anche relativamente scarsa risoluzione asse z. Mentre l&#39;acquisizione di più gruppi in STED, la cura deve essere presa per evitare lo sbiancamento del campione, e se necessario, può ridurre la linea di media o laser intensità potere per farlo. Anche in questo caso, occorre notare che se l&#39;imaging altri fluorofori che non sono adatti per STED, l&#39;applicazione del fascio esaurimento nella prima scansione sequenziale impedirebbe emissione di questi canali. Pertanto, un approccio STED / confocale misto (quando si utilizza la scansione confocale in canali che emettono ad una lunghezza d&#39;onda superiore a 592 nm), purtroppo, non essere adatto per il 3D. Per riassumere, abbiamo scelto STED come un approccio a causa della sua relativa facilità di applicazioneblicazione e il miglioramento della risoluzione rispetto confocale standard. Per l&#39;imaging sinapsi immune, si è dimostrato una tecnica efficace e prezioso che ci permette di vedere i dettagli in architettura non è possibile F-actina ad una risoluzione di oltre 200 nm. Mentre molti di questi dettagli sembrano sottili, possono avere un profondo effetto sulla funzione delle cellule NK. Quindi, stiamo applicando le più moderne tecnologie di imaging nanoscopica per derivare informazioni che è fondamentale per mantenere la salute umana.

La sinapsi immunologica è un complesso ambiente di proteine ​​di segnalazione ed elementi del citoscheletro. La sinapsi citolitica è stato originariamente descritto come un &quot;occhio di bue&quot; come la struttura con un anello di actina e di adesione delle molecole che circondano un dominio centrale secretoria 1-4. Tuttavia, ora sappiamo che essa consiste di domini microscopici di segnalazione attivo che richiedono continua riorganizzazione del citoscheletro dinamico per la funzione 5-11. Molte delle informazioni che ora abbiamo circa la sinapsi è stata derivata da microscopio, e immunologi sono stati i primi ad adottare la tecnologia di imaging all&#39;avanguardia. Una di queste tecnologie romanzo è super-risoluzione microscopia. Microscopia ottica convenzionale è spazialmente limitata dalla barriera di diffrazione della luce, che definisce il limite inferiore di risoluzione per tutti microscopia a fluorescenza, compresi confocale, a circa 200 nm. Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state developed che permettono la risoluzione di sotto della barriera di diffrazione. Questi includono la stimolazione delle emissioni esaurimento microscopia (STED), microscopia illuminazione strutturata (SIM), microscopia stocasticamente risolti (STORM) e microscopia ottica fotoattivabile (PALM). Queste tecniche sono stati esaminati in dettaglio altrove 12-15, ma sono riportate qui di seguito. Subdiffraction limitata risoluzione è generato in modo unico in ciascun sistema. La selezione di una tecnica di super-risoluzione, dunque, deve essere dettata dall&#39;esperimento e sistema sperimentale di interesse. STED super-risoluzione si ottiene mediante una ad alta intensità toroidale del fascio di esaurimento che selettivamente &quot;silenzi&quot; di fluorescenza intorno ad ogni fluoroforo di interesse a seguito di eccitazione, con conseguente subdiffraction limitata microscopia a fluorescenza 16-18. Un vantaggio di STED è che l&#39;acquisizione delle immagini è rapida e richiede relativamente piccolo post-elaborazione. Mentre la selezione colorante è dettata dalle specifichetrale posizione del fascio di esaurimento, che nel sistema disponibile in commercio è situato a 592 nm, vari coloranti disponibili in commercio sono disponibili che rendono combinazioni di due fluorofori possibile. Inoltre, i giornalisti fluorescenti comunemente usati come GFP può essere ripreso, facendo esperimenti cellule vive possibili 19,20. Abbiamo precedentemente utilizzato STED per identificare e quantificare le regioni di ipodensità F-actina che vengono utilizzati dalle cellule NK per degranulazione 21,22. Proponiamo che STED è una buona scelta per l&#39;imaging sinapsi immunitario grazie alla sua disponibilità relativamente flessibile di fluorofori e il miglioramento superiore nella risoluzione nell&#39;asse xy. Inoltre, il sistema STED disponibile in commercio utilizzato per questi esperimenti, l&#39;uso di una alta velocità (12.000 Hz) scanner risonanza consente una rapida acquisizione di immagini con minimo danno ai campioni. Limitata flessibilità nella selezione colorante è considerato uno svantaggio di STED 12,tuttavia due colori STED è relativamente semplice con diversi fluorofori disponibili in commercio. L&#39;integrazione di STED con un microscopio confocale a scansione laser permette inoltre di ulteriori confocale in combinazione con STED, così mentre STED è limitata a due canali, strutture supplementari possono essere esposte in confocale con risoluzione di circa 200 nm (E. Mace, osservazioni non pubblicate ). Mentre si descrive l&#39;uso di STED per l&#39;imaging cellule immunitarie, questa tecnologia viene applicata ad una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule neurali, e per la visualizzazione di una varietà di strutture cellulari 23-26. SIM utilizza un approccio diverso per generare immagini subdiffraction limitata. Visualizzando noti schemi di eccitazione periodica, le informazioni possono essere ottenute sulla struttura sconosciuta essere studiati seguente trasformazione matematica 27. Questo produce un aumento della risoluzione a ~ 100 nm lateralmente 28,29. Il vantaggio di SIM è che is compatibile con tutti i coloranti confocali standard e sonde, ma lo svantaggio è che è molto più lento di acquisire immagini e questi richiedono lunga post-elaborazione 12. Ciò limita anche il suo utilizzo per l&#39;imaging cellulare dal vivo. Infine, immagini super-risoluzione possono essere generati da stocastico foto-commutazione di fluorofori. Questo approccio viene sfruttata in foto-attivato la localizzazione di microscopia (PALM) e stocastico di microscopia ottica ricostruzione (STORM). Con la scansione di più fotogrammi della telecamera e localizzare molecole attivate in modo casuale che sono attivati ​​&quot;a&quot; e &quot;off&quot; nel corso del tempo, le immagini con risoluzione di 20-30 nm sono generati da fotogrammi accumulati 30-32. Il trade-off di questa risoluzione è il tempo richiesto per acquisire immagini. Qui vi mostriamo, in dettaglio, il protocollo per la preparazione e l&#39;imaging di campioni a due colori in STED. In questo sistema, è eccitazione con un pulsata, sintonizzabile, laser a luce bianca. A causa della naturadel fascio di eccitazione a impulsi, tempo di controllo di rilevamento è resa possibile e risoluzione ulteriori aumenti. Inoltre, il sistema è dotato di gadolinio ibrido (HYD) rivelatori, che sono più sensibili di tubi fotomoltiplicatori tradizionali, consentendo così bassi requisiti di potenza laser. Il fascio esaurimento per STED viene applicato continuamente ed è sintonizzato a 592 nm, che detterà la scelta di coloranti disponibili per due colori STED. Combinazioni di colorante comunemente usati generalmente includono una eccitabili da 488 nm (come Alexa Fluor 488, Oregon Verde, DyLights verdi, o Chromeo 488) e uno eccitabile da 458 nm (ad esempio Pacific Arancio o Horizon V500). Così, mentre il rilevamento dei due coloranti sarà in un range simile (ed entrambi sono accessibili dal laser esaurimento), eccitazione si verifica con diverse lunghezze d&#39;onda. Con rilevatori laser luce e accordabili bianchi accordabili, segnale di massimizzare eliminando sovrapposizione spettrale è reso abbastanza facile. Come tale, abbiamo avuto un buon successo con combinationi di coloranti disponibili in commercio, come Pacific Orange e Alexa Fluor 488 (usato qui). Il nostro protocollo è orientato verso e descrive la valutazione di cellule NK umane che rappresenta il fulcro storico del nostro laboratorio. Stiamo in particolare utilizzando la linea cellulare NK92 in questo esempio come quello è quello che abbiamo regolarmente applicate nel nostro lavoro sperimentale 21,33.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Cellule killer naturali formano strettamente regolamentati, le sinapsi immunologica finemente sintonizzato (IS), al fine di lisare cellule infettate da virus o tumorali. Actina riorganizzazione dinamica è fondamentale per la funzione delle cellule NK e la formazione della IS. Imaging di F-actina alla sinapsi ha tradizionalmente utilizzato microscopia confocale, tuttavia il limite di diffrazione della luce limita risoluzione di microscopia a fluorescenza, compresi confocale, a circa 200 nm. I recenti progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso lo sviluppo di subdiffraction limitata super-risoluzione di immagini. Per visualizzare all&#39;architettura F-actina presso la IS si Ricapitoliamo il citotossica delle cellule NK sinapsi aderendo cellule NK di attivare il recettore su vetro. Abbiamo poi le proteine ​​di immagini di interesse utilizzando due colori esaurimento emissione stimolata di microscopia (STED). Ciò si traduce in &lt;80 nm risoluzione alla sinapsi. Qui descriviamo le fasi di preparazione del campione e l&#39;acquisizione di immagini utilizzando dual colo STED nanoscopia per visualizzarne la F-actina al NK IS. Abbiamo anche illustrare l&#39;ottimizzazione dell&#39;acquisizione campione utilizzando software SP8 Leica e time-gated STED. Infine, utilizziamo software Huygens per la post-elaborazione deconvoluzione delle immagini.

Chiaramente, un obiettivo primario di super-risoluzione di immagini sarà un miglioramento rispetto microscopia confocale convenzionale. Tuttavia, ci sono alcuni problemi comuni che possono portare a una risoluzione ottimale. Questi richiedono che ogni esperimento essere ottimizzato individualmente. Nel nostro esperimento rappresentativo, stiamo IMAGING la rete F-actina in cellule NK attivate da anticorpo legato al vetro. Le cause comuni di (e correzioni per l&#39;) mancanza di migliore risoluzione di STED confocale sopra sono i seguenti: <ol><li> Sotto-campionamento (Figura 1a). Ciò può condurre a granulosità e la perdita di informazioni dei pixel, come mostrato dalla scarsa risoluzione di filamenti di F-actina. Aumento della linea o telaio media spesso può correggere questo. </li><li> Candeggio e / o sovra-campionamento (Figura 1b). Ciò può essere causato da lungo tempo di sosta pixel come un risultato di un eccessivo linea media. In alternativa, può essere un risultato di un eccesso di scansione dell&#39;immagine prima dell&#39;acquisizione, compreso uso eccessivo diil laser esaurimento. Questo comunemente si traduce in immagini confuse o sfocate. Questo può essere corretto scansione del campo di interesse solo minimamente prima di acquisire o, se possibile, aumentando la velocità di scansione laser. Se il problema persiste, la potenza del laser esaurimento può essere ridotto. </li></ol> Con il raggiungimento del giusto equilibrio di tempo pixel sosta, potenza del laser di eccitazione, e la potenza del laser esaurimento, un&#39;immagine con una migliore risoluzione e informazioni sufficienti può essere generato (Figura 1c). La risoluzione può essere ulteriormente migliorata con l&#39;uso di deconvoluzione (Figura 1d). Quando l&#39;acquisizione è ottimizzato, deconvoluzione migliorerà la risoluzione sia qualitativamente che quantitativamente e sub-100 nm risoluzione dovrebbe essere di routine raggiungibile. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Figura 1. Ottimizzazione di acquisizione e trabocchetti comuni di immagini STED. NK92 cellule sono state attivate su vetro rivestito anti-CD18 e-NKp30 per 20 minuti, allora fisso, permeabilizzate e colorate per la F-actina con falloidina Alexa Fluor 488.) L&#39;esempio di perdita di informazioni dell&#39;immagine a causa di sotto-campionamento. b) Un esempio di perdita di risoluzione a causa di sbiancamento / over-sampling c) le condizioni d ottimizzato) condizioni ottimizzate portano ad un miglioramento maggiore risoluzione deconvoluzione. Barra della scala = 5 micron.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Qui illustriamo il protocollo per l&#39;imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine ​​sinaptiche e il citoscheletro.

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K Views.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  Qui illustriamo il protocollo per l'imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine ​​sinaptiche e il citoscheletro. 

Video: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

L&#39;esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

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Immunologia e infezioni

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Facilitare l&#39;analisi dei dati immunologici con Visual tecniche analitiche

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...