We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children&#8217;s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.

1. Preparazione di liposomi <ol><li> Calcolare la quantità di soluzioni madre cloroformio-sospeso di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-cap Biotinyl (biotina-PE) fare scorte diluiti alla concentrazione finale desiderata. Per concentrazioni finali di 400 mM e 80 mM DOPC fosfolipidi biotina-PE a 10 ml ciascuno, inizia ponendo 629 ml di 10 mg / ml e 88 ml DOPC 10 mg / ml biotina-PE in provette di vetro cromatografia separati. NOTA: è importante pulire vetro Hamilton siringhe e provette per cromatografia in vetro con una soluzione (1 L 95% di etanolo di idrossido di 120 ml di acqua contenente 60 g di potassio, KOH) la pulizia, durante il trasferimento di soluzione madre di cloroformio-sospensione di DOPC e biotina-PE. </li><li> Essiccare il cloroformio con un flusso di argon nella cappa chimica. Sigillare il tubo cromatografia per parafilm. </li><li> Sottoporre liposomi appena essiccato a vuoto spinto in un lyophilizer O / N per rimuovere qualsiasi residuo di cloroformio. Per il completamento dello stesso giorno, a secco per 60-90 min. </li><li> Mentre le piste liofilizzatore, preparare qualche tampone di diluizione. Per questo protocollo, preparare 25 ml costituiti Tris 25 mM, pH 8,0; 150 mM NaCl; e 2% (in peso) n-ottil-β-D-glucopiranoside (OG) detergente. Mescolare i primi due ingredienti insieme, quindi spostare l&#39;ossigeno con argon prima di aggiungere la polvere secca OG. Dopo la preparazione, filtrare la soluzione OG con membrana in acetato di cellulosa 0,2 micron, e conservare a 4 ° C. </li><li> Inoltre, preparare due bottiglie tappo a vite di 1 L di tampone Tris-salino alle stesse concentrazioni, ma senza OG. Posizionare un ancoretta magnetica puliti acqua distillata in fondo di ogni. Preparare 6 litri supplementari del tampone Tris-salino. Rimuovere ossigeno da tutte le bottiglie con argon e metterli a 4 ° C e. </li><li> Dopo liofilizzazione, sciogliere i lipidi essiccati nel buffer Tris-OG salina per ottenere una soluzione 4 mM di ciascuno. Seguendo l&#39;esempiovolumi, aggiungere 2 ml al tubo DOPC, e 0,2 ml al tubo biotina-PE. </li><li> Mescolare i lipidi biotina-PE con i lipidi DOPC. Questo migliora la mobilità della SLB, come la biotina accoppiato può compromettere la fluidità dei gruppi di testa fosfato. Per effettuare una concentrazione finale di 80 mM biotina-PE, miscela 0,2 ml di 4 mM biotina-PE e 1 ml di DOPC 4 mM. Quindi aggiungere 8,8 ml di tampone Tris-OG salina. </li><li> Per una concentrazione finale di 400 micron DOPC, semplicemente mescolare 1 ml di DOPC 4 mm con 9 ml di OG Tris-salino. </li><li> Riempire il sonicatore con acqua ghiacciata. Inserire il tubo di vetro contenente il fosfolipide diluito nel centro del sonicatore utilizzando un morsetto di utilità. Sonicare fosfolipide diluito per 10 minuti fino a quando la soluzione diventa chiara. NOTA: Aggiungere il ghiaccio in bagno d&#39;acqua sonicatore per mantenere bassa la temperatura dal ultrasuoni genera calore. </li><li> Riempire i tubi con argon per spostare l&#39;ossigeno nell&#39;aria sopra il liquido, e sigillare con parafilm. </li></ol&gt; 2. Dialisi di liposomi <ol><li> Tagliare due tratti di tubo di dialisi secco (Peso molecolare cut-off: 12-14,000, diametro: 6,4 mm) di lunghezza appropriata (in questo esempio, 40 cm), uno per ogni diluizione fosfolipide, dal rotolo. </li><li> Reidratare sezioni dei tubi, consentendo loro di ammollo in 200 ml di acqua distillata in un bicchiere di vetro per 2 min. </li><li> Microonde questo per 5 min a un valore elevato, o almeno fino a quando l&#39;acqua arriva ad ebollizione. </li><li> Fare un nodo ad una estremità di ciascun tubo e risciacquare l&#39;interno con pochi millilitri di tampone Tris-salino-OG. Successivamente, meticolosamente spremere tanto di questo tampone di lavaggio possibile per minimizzare la quantità di buffer residuo all&#39;interno. </li><li> In una cappa a flusso laminare, aggiungere i fosfolipidi diluiti in ciascuna provetta e serrare le estremità aperte con una piccola chiusura del tubo di dialisi in modo da escludere l&#39;aria. Completa esclusione dell&#39;aria richiederà il sacrificio di un piccolo volume di campione serraggio sotto l&#39;&amp;# 8220; linea di galleggiamento &quot;. </li><li> Immergere i campioni in bottiglie preparate in precedenza di tampone Tris-salino, senza OG. Spostare l&#39;ossigeno in bottiglia con argon prima di ri-sigillatura e posto a mescolare O / N a 4 °. </li><li> Trasferire il tubo in un nuovo flacone di tampone Tris-salino senza OG ogni 12 ore per almeno 3 volte. </li><li> Poco prima della rimozione dei lipidi dializzati, preparare una serie di tubicini in cui aliquota lipidi riempiendo ciascuna con argon per spostare l&#39;ossigeno. </li><li> Dopo 36 h, prendere le bottiglie dialisi nella cappa a flusso laminare e rimuovere i tubi di dialisi dalle bottiglie. Avere un pannolino panchina o bicchiere a portata di mano per raccogliere il deflusso bagnato. </li><li> Tagliare il tubo di dialisi sopra la clip, quindi rimuovere la clip e trasferire con cura la soluzione lipidica dializzata via pipetta in 1 ml aliquote in tubi pre-preparati riempite con gas argon sul ​​ghiaccio. </li><li> Aliquota della soluzione acquosa liposomi, utilizzare il flusso di argon per spostare l&#39;ossigeno di nuovo in ogni tubo. </li><li> Conservare i liposomi a 4 °. Non congelare. </li></ol> 3. Determinazione di anticorpi Densità sul doppio strato lipidico <ol><li> Preparare una serie di diluizioni di biotinilato, anticorpo fluorescenza marcata, 50 ml di volume per ogni diluizione, alle seguenti concentrazioni: 0 nM (vuoto), a 10 nm, 50 nm, 100 nm e 500 nm. (Di seguito indicato come &quot;serie di campioni&quot;). </li><li> Aggiungere 1 ml di perline di silice in 6 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti v-bottom. Assicurarsi di scuotere le perle ben prima pipettare, in quanto tendono a stabilirsi. NOTA: Se aver ordinato perline secco piuttosto che sospeso, seguire le istruzioni del produttore per diluire. </li><li> Per queste perle, aggiungere 2 ml di DOPC misto: fosfolipidi Biotinyl in un rapporto 1: 1. Fate questo per ogni bene. </li><li> Pulse la piastra su un vortex a forza media 3 volte per 10 secondi ciascuna per favorire l&#39;interazione con le perline e fosfolipidi. </li><li> Aggiungere 150 ml di 5% casein ciascun pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù tre volte. </li><li> Sia la piastra incubare nella soluzione di caseina per 10 minuti, poi lavare fuori. Per lavare, riempire ogni bene per un volume totale di 250 microlitri con HEPES Buffered Saline (HBS) con albumina sierica umana 1% (HSA). Centrifugare a 1000 xg per 2 min. Pipetta fuori e scartare i primi 200 ml di surnatante, e ripetere due volte per un totale di tre cicli di lavaggio. </li><li> Aggiungere 50 ml di streptavidina a 333 ng / ml concentrazione. Pulse la piastra di nuovo 3x 10 sec, e lasciate riposare su un agitatore per 15 minuti. Lavare 3x come nel passaggio 6 per rimuovere streptavidina non legato. </li><li> Aggiungere 50 ml di anticorpo biotinilato fluorescente dalla serie di diluizioni precedentemente preparato (vedi punto 3.1) per ciascun bene, e sostituire la piastra sul shaker per 20-30 min. Lavare 3x come nel passaggio 6 per rimuovere l&#39;anticorpo non legato. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 100 ml di HBS / 1% HSA, poi il trasferimento ad un tubo FACS. Ripetere questa due volte perassicurare la rimozione efficiente di tutti perline dal pozzo, per un totale di 300 microlitri, e farlo per ogni pozzetto. </li><li> Portare i tubi risultanti al citometro di flusso. E &#39;tempo di leggerli. </li><li> Aggiungere 1 goccia dalla bottiglia &quot;B&quot; dal kit tallone calibrazione dell&#39;intensità della fluorescenza (FIC) (di seguito denominato &quot;serie standard&quot;) ad un tubo FACS, e diluire con 300 ml di HBS / 1% HSA. </li><li> Leggere questo tubo, ma non registrare i dati appena ancora. Per ora, è sufficiente assicurarsi che le perle bianche siano azzerati. Effettuare un istogramma che mostra la fluorescenza delle perline misurati nel canale appropriato, quindi spostare la tensione del laser di eccitazione finché il picco è sul lato più a sinistra dell&#39;istogramma. </li><li> Rimuovere il tubo e aggiungere 1 goccia di ciascuno degli altri 4 tubi della serie (contrassegnata con 1 a 4) alla stessa provetta. Ora, mettere il tubo nella macchina di nuovo, e registrare i dati risultanti, che dovrebbe apparire come 5 cime distinte. </li&gt; <li> Leggi ogni singolo tubo della serie di campioni. </li><li> Utilizzando il software di analisi FACS, elaborare un cancello che copre l&#39;intera larghezza di ogni picco nella serie istogramma standard al punto a metà-massimale. Questa è una porta per ogni picco. Fare lo stesso per ogni campione. Si noti la MFI (media di fluorescenza intensità) per ogni porta. </li><li> Utilizzando un programma di foglio di ingresso i valori MFI misurati nel posto appropriato. Anche l&#39;ingresso MESF (molecole di equivalenti Solubile Fluorocromo) Valori (numero medio di molecole fluorescenti rivestimento ciascuna sfera) per ogni bottiglia della serie standard. Queste informazioni possono essere trovate seguendo le indicazioni sulla plastica scuotono i tubi sono venuti in. </li><li> Utilizzare il foglio sarà tracciare la MFI contro i valori Mesf, creando una correlazione lineare tra il numero di fluorofori e l&#39;intensità misurata. </li><li> Utilizzare il modulo di &quot;proteine ​​e le etichette &#39;nello spettrofotometro micro-volume per determinare il rapporto di colorante proproteina nella anticorpo marcato. </li><li> Input dell&#39;efficienza etichettatura della proteina di esempio, il diametro medio delle perline rivestite con lipidi, e il valore MFI per ogni voce. Il foglio utilizzerà automaticamente la formula dal grafico linea generata nel passaggio 3.16 per calcolare i valori Mesf per ogni diluizione di proteine ​​e la densità di semina della proteina campione per ogni concentrazione. </li></ol> 4. isolando e coltivando NK cellule umane <ol><li> Aliquota 15 ml di sangue periferico o cappotto buffy in una provetta da 50 ml. Diluire questo sangue con PBS contenente 1% FBS nel rapporto di 1: 1. </li><li> Aggiungere 13 ml di Ficoll delicatamente sul fondo del tubo con una pipetta 10 ml sierologica. </li><li> Centrifugare questo tubo per 20 minuti a 1200 xg con l&#39;acceleratore e la rottura off o le impostazioni più basse. </li><li> Dopo centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere nuvoloso strato intermedio bianco fluttuante delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), which dovrebbe sedersi e l&#39;intersezione tra una chiara strato superiore giallo e uno strato più torbida pallido color inferiore, entrambi i quali siedono sopra strato inferiore di globuli rossi (RBC). NOTA Non raccogliere eventuali globuli rossi nel raccogliere il PBMC. </li><li> Posizionare le PBMC raccolti in un nuovo tubo conico da 50 ml, e portare a capienza con PBS contenente 1% FBS. Centrifugare nuovamente, questa volta con il freno e dell&#39;acceleratore al massimo, per 5 minuti a 300 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente 1% FBS. </li><li> Contare le cellule, mentre centrifugazione ancora una volta con le stesse impostazioni come al punto 4.6. </li><li> Eliminare il supernatante ancora una volta, e risospendere le cellule in R10 mezzo ad una densità di 10 milioni di cellule / ml. </li><li> Prendere 30 milioni di cellule in una provetta di polistirene da 5 ml e isolare le cellule NK utilizzando un kit di separazione magnetica, seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver isolato, contare le cellule una più e risospendere ad una densità di 500,000 cellule / ml in terreno completo R10 (88%; RPMI 10% FBS, 1% HEPES; 1% di sodio piruvato) supplementato con IL-2 (100 U / ml). Cultura a 37 ° in un incubatore CO 2, e sostituisce media 2-3 volte a settimana. </li></ol> 5. Montaggio del Glass-supportata Planar doppio strato lipidico <ol><li> Preparare la soluzione Piranha 100 ml miscelando 30% di perossido di idrogeno con acido solforico a un rapporto di 1: 3 in un becher. NOTA: Eseguire sempre il lavoro con agenti nocivi come l&#39;acido solforico in una cappa correttamente designato. </li><li> In questa soluzione, immergere 2 rettangolari # 1.5 vetrini in soluzione piranha per 20-30 min. NOTA: E &#39;indispensabile pulire i coprioggetti dai soluzione piranha. </li><li> Mentre i coprioggetti vengono puliti, prendere 1 tubetto di precedentemente preparato 400 mM lipidi DOPC e 1 tubetto di precedentemente preparato 80 micron lipidi biotina-PE. Trasportarli sul ghiaccio al serbatoio argon. </li><li> Spostare l&#39;ossigeno in una nuova provetta con argon,quindi aggiungere insieme la DOPC e biotina-PE in un rapporto 1: 1. Il volume specifico varierà in base alle esigenze sperimentali, ma deve essere di minimo 2 ml ciascuno. Spostare l&#39;ossigeno nel tubo miscela ancora una volta con il gas argon, e singoli tubi reagenti e, prima di tornare a quest&#39;ultimo di frigorifero. </li><li> Dopo che sono finiti pulire, lavare accuratamente i coprioggetti con acqua distillata. Impostare i coprioggetti fuori ad asciugare per qualche minuto. </li><li> Prelevare 1,5 ml di miscela liposomi preparato al punto 5.4 e Aliquotare in una singola goccia in una delle camere di corsia della camera di diapositiva. L&#39;uso di 2 gocce per corsia è tipico, ma non necessario. </li><li> Introdurre rapidamente e in modo efficiente il vetrino secca sopra le goccioline. Assicurarsi che le gocce sono sufficientemente distanziati in modo che non si fondono volta il vetrino è collocato. Inoltre, assicurarsi che le gocce rimangono circolare e ben definita, senza toccare i bordi delle pareti della camera. Premere con decisionein e attorno a ogni corsia per assicurare la tenuta stagna tra il vetrino e scivolo. </li><li> Segnare le posizioni delle gocce con un pennarello </li><li> Passare 100 ml di soluzione acquosa di caseina 5% attraverso la camera di bloccare il doppio strato. Cercate di fare in modo che non vi siano bolle nella camera di flusso. </li><li> Iniettare 100 ul di streptavidina ad una concentrazione di 333 ng / ml in ogni corsia. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare eseguendo 3 ml di HBS / 1% HSA attraverso ogni corsia per rimuovere l&#39;eccesso streptavidina. </li><li> Aggiungere 100 ml di biotinilato fluorescente anti-CD16, come Alexa Fluor 568 alla concentrazione di proteine ​​precedentemente determinato per essere più efficaci nel capitolo 3. Incubare al buio per 20-30 min. Lavare nuovamente eseguendo 3 ml di HBS / 1% HSA attraverso ogni corsia. </li><li> Flusso 100 ml di D-biotina ad una concentrazione di 25 nM attraverso la camera allo scopo di impegnare qualsiasi streptavidina eccesso e quindi eliminare la possibilità di legame non specifico di streptavidin alle cellule. </li><li> Contare le cellule NK e risospendere alla concentrazione di 500.000 / ml in HBS / 1% HSA. </li><li> Mentre filatura le cellule, lavare la D-biotina dalla camera con un altro 3 ml di HBS / 1% HSA per corsia. </li><li> Controllare la mobilità di ligandi sulla SLB di FRAP (FRAP) su una fluorescenza totale interna riflessione (TIRF) o la microscopia confocale prima di aggiungere le cellule NK. </li><li> Una volta che le cellule hanno finito di filatura e sono state risospese alla concentrazione desiderata, aggiungere 100 microlitri per ogni corsia. </li><li> Posizionare la camera in un incubatore CO 2 37 ° 5% per 30-60 min. </li><li> Dopo questo periodo di incubazione, fissare le cellule con 4% paraformaldeide a temperatura ambiente per 10-20 min. Lavare eseguendo 3 ml di PBS attraverso ogni corsia per rimuovere la paraformaldeide. </li><li> Aggiungere 400 microlitri tampone di bloccaggio (siero asino normale 5% e il 0,2% Tritron X-100 in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Stain F-actina e perforina dall&#39;inserzionistading 200 ml di diluito falloidina fluorescenza marcata (1 unità / ml falloidina etichettato) e fluorescenza marcata anti-perforina monoclonale (500 ng / ml mAb anti-perforina). Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare eseguendo 3 ml di PBS. La camera è pronta per l&#39;imaging. </li></ol> 6. Imaging del NK Synapse su doppio strato lipidico con STED <ol><li> Attivare tutti i moduli hardware necessari. </li><li> Avviare il software di analisi delle immagini. Attiva sia la scansione di risonanza e moduli STED. Dopo aver fatto queste selezioni, attendere circa 3-5 minuti per il software per iniziare. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Configurazione&quot; nella parte superiore dello schermo. </li><li> Selezionare &quot;Config Laser&quot;, quindi accendere la luce bianca e STED 592 nm laser. </li><li> Scegliere l&#39;obiettivo 100X, e allineare il raggio laser di eccitazione con il laser esaurimento 592 nm. </li><li> Selezionare il modulo &quot;Laser Config&quot;, spegnere il 592 esaurimentolaser, e accendere il laser esaurimento 660 nm. </li><li> Posizionare il vetrino sul palcoscenico, sopra l&#39;obiettivo. Portare le cellule legate alla regione delimitata doppio strato a fuoco utilizzando la lampada a luce bianca e gli oculari. </li><li> Ritorna alla scheda &quot;Acquisizione&quot;, direttamente a destra della scheda &quot;Configurazione&quot;. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Passa a Whitelight&quot;, quindi accendere quel modulo sulla e trascinare la linea laser di eccitazione per la lunghezza d&#39;onda appropriata. </li><li> Selezionare il rivelatore desiderato dalla lista di quelli disponibili, quindi impostare l&#39;intervallo di rilevamento per comprendere la gamma appropriata di lunghezze d&#39;onda. NOTA: Non mettere mai il campo di rilevamento direttamente sotto il fascio di eccitazione. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Seqential&quot; in-sinistra &quot;Acquisisci&quot; barra degli strumenti per aprire il dialogo di scansione sequenziale in fondo alla barra degli strumenti di sinistra. Questo consente all&#39;utente di aggiungere più sequenze, ciascunacon un diverso fascio di eccitazione per un altro colore. Fare clic su &quot;Tra Frames&quot;, e quindi impostare la frequenza di eccitazione, detector, e campo di rilevamento per ogni colore supplementare come nei passi 6.9 e 6.10. </li><li> Una volta che tutte le impostazioni sono ottimizzate, premere &quot;Start&quot; per iniziare il processo di acquisizione. </li><li> Applicare il software deconvoluzione gratuito (Huygens) con un ambiente progettato per STED deconvoluzione, come descritto in precedenza 13. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+immunological+synapses.">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. u. p. f. e. r. H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers.">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li><li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces.">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li><li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time,+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins.">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers.">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution.">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+(TIRF-STED-FCS).">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li><li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses.">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li><li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells.">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture.">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La novità di questo studio è che combina la tecnica SLB con STED di studiare le sinapsi delle cellule NK. Precedenti studi hanno ripreso il doppio strato lipidico con TIRF di studiare cellule T sinapsi formazione 8 e segnalazione traffico molecola sulla membrana plasmatica 6. Altri hanno descritto STED imaging sinapsi delle cellule NK con anticorpi rivestita vetrini 13,14. Il metodo ibrido descritto qui ulteriormente basa su questi sforzi di imaging sinapsi delle cellule NK con la chiarezza migliorata offerta da super-Resolution Imaging sulla superficie doppio strato lipidico, che modelli migliori la superficie dinamica di APC. Anche se SLB sono membrane artificiali prive di citoscheletro, zattere lipidiche, e altri leganti che le cellule bersaglio reali o APC possesso, questa tecnica può ricapitolare caratteristiche importanti come la mobilità e l&#39;orientamento dei ligandi. Questo permette al sistema SLB per servire come un approccio riduzionista in dissezione tegli contributo dei singoli recettori e ligandi per formazione della IS e la dinamica di IS. La caratteristica più importante di SLB è che i ricercatori possono combinare questa tecnica con approcci di imaging ad alta risoluzione, come la microscopia confocale e TIRF. L&#39;introduzione della microscopia STED aumenta ulteriormente questo vantaggio, fornendo approfondimenti senza precedenti in è la ricerca e le sue applicazioni cliniche. Un potenziale critica di questo sistema è che la SLB non adeguato imitare il complesso superficie di un APC, dando così origine a caratteristiche anatomiche potenzialmente non fisiologiche nelle sinapsi risultanti. Se è vero che il repertorio limitato di molecole di superficie sul SLB non ricapitolare completamente la superficie eterogeneo popolato di APC, questo limite può anche essere vantaggioso in quanto permette investigatori per determinare l&#39;influenza di recettore e ligando singoli sulla formazione sinapsi . Tqui ci sono diversi passi decisivi nel processo. Tra i più critico è che l&#39;ossidazione dei liposomi essere evitato con costante di argon per spostare l&#39;ossigeno nel tubo e la soluzione, ad esempio nelle fasi 1.10, 2.6 e 2.11. L&#39;ossidazione dei lipidi comporterà mobilità lipidi diminuito, impedendo così la capacità delle proteine ​​di superficie di muoversi liberamente e partecipare strutturazione sinaptica. Allo stesso modo, è anche fondamentale per rimuovere tutto il cloroformio nel liposoma mediante liofilizzazione (passo 1.2). Nella determinazione della densità proteine ​​nel doppio strato lipidico, è di importanza per disperdere dapprima le perline di silicio in una sospensione omogenea privo di cluster. Se necessario, sonicazione di perline può essere applicata. Nel montaggio della SLB, i primi passi (5,1-5,8) in cui i coprioggetti sono puliti, le gocce sono posti, e coprioggetto è apposto sono vitali. Un errore in qualsiasi di questi può necessitare di iniziare l&#39;esperimento sopra (dall&#39;inizio della sezione 5). Per questo motivo, èbuona norma pulire più vetrini che saranno necessari per risparmiare tempo in caso di un incidente. Non-cluster è il problema più frequente quando si lavora con questo sistema. Se, quando la visualizzazione delle cellule nella fase finale, non si riesce a trovare nessuna sinapsi fluorescenti, ci sono alcuni passaggi che possono essere adottate. Un&#39;altra macchia per il recettore della superficie cellulare affine può essere aggiunto alla camera per verificare che la cella non ha formato una sinapsi con il doppio strato, mentre le cellule possono aderire non specifico alla superficie coprioggetto vetro o doppio strato, proteine ​​di superficie sinapticamente-coinvolti voglia apparire cluster distinte sul piano dell&#39;interfaccia cellule doppio strato, mentre le proteine ​​di superficie unengaged dovrebbero apparire come colorazione diffusa intorno al perimetro della cella. Qualora questo metodo fallire, si dovrebbe verificare le loro cellule tramite citometria a flusso per garantire che il particolare marcatore Lui spera di studiare è espresso in adeguata abbondanza sulla superficie cellulare. Alcuni prote superficieins sono noti per essere down-regolato su lungo termine nella cultura vivo. Mentre questo protocollo dettagli specificamente come visualizzare NK formazione di sinapsi cellule, il sistema SLB può essere usato per studiare la formazione di sinapsi in qualsiasi immunocyte immaginabile semplicemente la sostituzione del legante primaria nel passaggio 5.11. Più ligandi possono anche essere aggiunti simultaneamente. Uno inoltre non è necessario utilizzare un sistema streptavidina-biotina per aderire le proteine ​​di superficie all&#39;interno del doppio strato. Nickel-NTA: interazioni istidina sono anche vitali. Tuttavia, a causa della elevata resistenza e la specificità della streptavidina: interazione biotina, nostro laboratorio preferisce questo sistema. Si può anche variare la concentrazione di cellule aggiunti sul doppio strato dalla densità prescritta al punto 5.13, nonché la durata del successivo periodo di incubazione per osservare sinapsi a diversi stadi di maturazione. Questo può anche essere fatto vivo, anche se questo ovviamente esclude la possibilità di visualizzare str intracellulareuctures (a meno che non siano già etichettati con tag fluorescenti fuso; il nostro laboratorio utilizza alcune di queste linee cellulari alterati). A causa dell&#39;alto grado di personalizzazione possibile in questo protocollo, si può usare la tecnica di base SLB, insieme a immagini STED, per affrontare una gamma incredibilmente varia di domande in immunologia, biologia cellulare, biochimica, tra cui la dinamica dei lipidi di base 15, la formazione di sinapsi 16, intracellulare di segnalazione 17, e delle cellule metastasi tumorali 18.

La sinapsi immunologica (IS) si trova ad una svolta importante per l&#39;attivazione e la funzione 1 cella. È il mezzo principale con cui presentazione dell&#39;antigene e l&#39;immunità cellulo-mediata vengono effettuate. I primi studi microscopici di formazione di sinapsi utilizzato un sistema coniugato cellula-cellula 2. La limitazione principale con questo approccio è che la maggior parte dei coniugati saranno lette &#39;profilo&#39;, per così dire, limitando così vista dell&#39;osservatore della struttura sinaptica stessa. Nel 1999, il laboratorio di Dustin affrontato questa limitazione utilizzando il vetro supportato doppio strato lipidico (SLB) tecnica 3, che era stato sperimentato in precedenza dal laboratorio 4,5 McConnel. Questo approccio smaltiti cellule presentanti l&#39;antigene (APC), a una superficie planare lipide-oggetti sostenuto, in cui proteine ​​potrebbero essere collegati e si muovono liberamente in due dimensioni. Utilizzando questo metodo, Dustin e colleghi sono stati in grado di scrutare direttamente su in tegli sinapsi utilizzando microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, e per la prima volta ottenere un aspetto &quot;faccia a faccia&quot; alla struttura del IS. Con l&#39;uso del sistema SLB, dettaglio con cui l&#39;IS può essere visualizzata è limitata solo dalle limitazioni delle tecniche di imaging attuali 6-8. Utilizzando tecniche di illuminazione standard, la risoluzione minima (cioè, la distanza minima tra due oggetti distinti in cui possono essere distinti) è stata &lt;200 nm sulla base del criterio di Rayleigh 9. Questo limite ostacola l&#39;imaging molto fini, strutture di scala molecolare che compongono la sinapsi, e fino allo sviluppo di tecniche di imaging super-risoluzione 10-12, visualizzazione di queste strutture è stato limitato a immagini di cellule fissate mediante microscopia elettronica. Con il recente avvento di una varietà di tecniche di super-risoluzione, come SIM (microscopia illuminazione strutturata), PALM (microscopia localizzazione fotoattivato), STORM (stocastica microscopia ottica ricostruzione), e STED 10-12, gli investigatori sono ora in grado di studiare queste strutture sinaptiche in dettaglio senza precedenti, che a sua volta ha fornito una comprensione sempre chiarito la IS. I vantaggi della microscopia STED sono stati descritti prima 13. Qui si descrive super-risoluzione di imaging con microscopia STED equipaggiato con la nuova concezione laser esaurimento 660 nm. Rispetto al tradizionale 592 nm laser esaurimento, il laser 660 nm consente una selezione più ampia di coloranti fluorescenti (vedi http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), specialmente in questi fluorofori rosse. Altre pubblicazioni hanno descritto imaging STED delle sinapsi delle cellule NK on legate agli anticorpi vetrini 13,14. Qui, il sistema di SLB è combinato con super-risoluzione STED microscopio per studiare la sinapsi delle cellule NK. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto anticorpivetrini rivestiti di essere un mosaico di fluido, in cui le proteine ​​di superficie incorporati possono muoversi liberamente in una superficie bidimensionale piatto (piano xy). Questo imita più fedelmente la superficie organica e mobile di una cellula bersaglio, e di conseguenza una migliore ricapitola la formazione di una sinapsi immunitario fisiologicamente rilevanti. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire all&#39;utente finale con una descrizione dettagliata di come rappresentare il sinapsi immunologica delle cellule NK, combinando il sistema SLB e super-risoluzione STED microscopio. Essa fornirà all&#39;utente finale con i provvedimenti necessari per: preparazione dei liposomi, costruire bistrati proteina-embedded, determinare la densità di proteine ​​sui doppi strati lipidici, e acquisire immagini super-risoluzione usando la microscopia STED. Queste tecniche non sono limitati al campo della immunologia, e possono essere ampiamente utilizzati in una varietà di discipline.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1330">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:316px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:475px;">Purpose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:283px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">850375C</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">18:1 Biotinyl Cap PE 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">870273C&#160;</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Argon gas, compressed</td>
			<td style="width:256px;">Airgas&#160;</td>
			<td style="width:316px;">UN1006</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A lyophilizer</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">Freezone 7740020</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lyophilizer tubes</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">7540200</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Chromatography Columns</td>
			<td style="width:256px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:316px;">sc-205558</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1 M Tris pH 8.0</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9856</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9759</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">O1008</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:256px;"><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&#160;</a></td>
			<td style="width:316px;">132676</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">96-well V-bottom polystyrene plate (untreated)</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:316px;">3896</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Non-functionalized silica beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:316px;">SS06N</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:316px;">14-959-2A&#160;</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">QuantumTM MESF beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:316px;">Variable</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Casein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">C0875</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">HEPES buffered saline + 1% HSA</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:316px;">434301</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Fluorescently-labeled biotinylated protein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">80608</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">25x75 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">10812</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrogen peroxide (30%)</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientic&#160;</td>
			<td style="width:316px;">BP2633</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">258105</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:256px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:316px;">B20656</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lens paper</td>
			<td style="width:256px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:316px;">54826-001</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Type F Immersion Oil</td>
			<td style="width:256px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:316px;">11 513 859</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A Leica TCS STED microscope</td>
			<td style="width:256px;">Leica</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

La Figura 1 mostra il risultato della densità anticorpi sul doppio strato lipidico. Il principio è quello di utilizzare perline standard per rendere la curva standard di MESF contro IFM tramite citometria a flusso (A). Il MFI della serie di campioni è stato convertito in MESF utilizzando la curva standard. La densità anticorpi sul doppio strato lipidico è linearmente correlata con la concentrazione di anticorpo (B). Figura 2 mostra l&#39;tripla colori STED immagine di NK sinapsi su vetro-supporto planare doppio strato lipidico. Anti-CD16 anticorpo sul doppio strato lipidico si accumula, innescando la formazione F-actina e la polarizzazione e la penetrazione della perforina attraverso la maglia F-actina sul pannello focale di sinapsi immunologica in cellule NK. Usando questo approccio combinato, si possono osservare le pulito microclusters di fluorescente anti-CD16 nel SLB, che rispecchia direttamente il raggruppamento di CD16 sulla cellula NK. Rispetto alla tradizionale immagine confocale, la struttura di CD16 central gruppo è più facilmente individuabile nell&#39;immagine STED causa la fluorescenza ambiente impoverito. Inoltre, l&#39;ultrastruttura del citoscheletro è visto con notevolmente migliorata risoluzione. In linea con precedenti osservazioni 16,17, i granuli litici perforina-positivi sono visti posizionati sopra le regioni a bassa densità di F-actina nell&#39;immagine STED, un dettaglio fondamentale che è principalmente perde nell&#39;immagine confocale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Figura 1. Densità di 3G8 anticorpi a doppio strato lipidico. (A) la correlazione lineare tra MESF e MFI per la serie standard. (B) la correlazione lineare tra la densità di proteine ​​e la concentrazione per una serie di diluizioni del campione di proteine, che mostra il numero di fluorescenza marcata proteine ​​monomeri per area unitaria in funzione della concentrazione crescente sul si lipidi rivestiteperline Lica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Figura 2. STED imaging NK sinapsi su planare doppio strato lipidico. Pile NK sono stati stimolati in SLB contenente biotinilato fluorescente anti-CD16 (rosso), fissi, permeabilizzate, e poi colorate con falloidina (blu) e anti-F-actina (verde). Una singola cellula è stato ripreso sotto la normale impostazione confocale, e quindi l&#39;impostazione STED. Immagini confocale e STED stati deconvoluto utilizzando il software Huygens. Bar, 1 micron scala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.2K Views.  Texas Children's Hospital. We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Video: Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Facilitare l&#39;analisi dei dati immunologici con Visual tecniche analitiche

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, however, the lateral resolution of super-resolution imaging is only ~100 nm. The low resolution is mainly due to the high autofluorescence background of photosynthetic cells caused by high-intensity lasers that are required for super-resolution imaging, such as stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, we describe a photobleaching-assisted STORM method which was developed recently for imaging the marine picocyanobacterium Prochlorococcus. After photobleaching, the autofluorescence of Prochlorococcus is effectively reduced so that STORM can be performed with a lateral resolution of ~10 nm. Using this method, we acquire the in vivo three-dimensional (3-D) organization of the FtsZ protein and characterize four different FtsZ ring morphologies during the cell cycle of Prochlorococcus. The method we describe here might be adopted for the super-resolution imaging of other photosynthetic organisms.

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Here we describe a photobleaching method to reduce the autofluorescence of cyanobacteria. After photobleaching, stochastic optical reconstruction microscopy is used to obtain three-dimensional super-resolution images of the cyanobacterial FtsZ ring.

Photobleaching permette l'Imaging a Super-risoluzione dell'anello FtsZ nel cianobatterio Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...