Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

We willen graag de UF-ICBR proteomics faciliteit voor hun verwerking van onze monsters te erkennen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).

De Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Florida goedgekeurd alle dierstudies.
1. Bereiding van reagentia
<ol><li>Bereid CHAPS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS en 1 proteaseremmer cocktailtablet per 50 mL buffer). Buffer zonder proteaseremmers kan tot 6 maanden bij 4 °C worden opgeslagen of buffer met proteaseremmer die tot 1 jaar bij -20 °C is opgeslagen.</li>
	<li>Bereid 100 m triethylammoniumbicarbonaat (TEAB): Voeg 500 μL van 1 M TEAB toe aan 4,5 mL ultrazuiver water.</li>
	<li>Bereid 200 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP): Voeg 70 μL van 0,5 M TCEP, een denaturing reagens, toe aan 70 μL ultrazuiver water. Voeg vervolgens 35 μL van de 1 M TEAB toe.</li>
	<li>Bereid 5% hydroxylamine voor: Voeg 50 μL van 50% hydroxylamine toe aan 450 μL of 100 mM TEAB.</li>
</ol>2. Eiwitextractie
<ol><li>Isoleer quadriceps spier van een geëuthanaseerde muis volgens een IACUC goedgekeurd protocol. Bevries en houd op -80 °C of ga verder met het protocol voor onmiddellijk gebruik.</li>
	<li>Snijd om ongeveer 10 mg vers of bevroren quadriceps muisweefsel te isoleren. Aparte vezels met behulp van pincet bij het werken met skeletspieren. Als alternatief, als het werken met celculturen, resuspend ~3 x 106 cellen in 300 μL van CHAPS lysis buffer en overslaan naar stap 2.4.</li>
	<li>Homogeniseren weefsel met behulp van een kraalvers disruptor met behulp van 2 mL buizen gevuld met ongeveer 200 μL van 1 mm zirconia/ silica kralen en 500 μL chaps lyse buffer. Schaal omhoog of omlaag naar gelang van het geval (bijvoorbeeld 5 mg weefsel in 250 μL CHAPS lyse buffer).</li>
	<li>Voer sonicatie uit (10x voor 10 s elk met 50% amplitude en 30 s intervallen op ijs) om eiwit vrij te geven dat aan DNA is gebonden. Dezelfde DNA-afbraakresultaten kunnen worden bereikt met spuitlyse door het lysate 10x door een 21 G naald aan een 1 mL-spuit te laten zitten, of door benzonase incubatie (44 U/mL) bij 37 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer het lysaat op 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C en breng het supernatant over op een nieuwe centrifugebuis.</li>
</ol>3. Eiwitmeting
<ol><li>Bepaal de eiwitconcentratie van de supernatant met behulp van vastgestelde protocollen (zie Tabel van materialen). LET OP: Het is het beste om monsters te gebruiken op ≥2 μg/μL, maar er kunnen ook minder geconcentreerde monsters worden gebruikt. Indien een minder geconcentreerd monster wordt gebruikt, moet de volumes van de reduceerende/alkylerende reagentia in stap 5.1 op passende wijze worden aangepast.</li>
	<li>Bereid een BSA standaard curve verdunning voor met chaps lyse buffer.</li>
	<li>Volg de instructies van de fabrikant, en na 15 min, lees de absorptie op 750 nm.</li>
</ol>4. Vermindering/alkylating reagensbehandeling
<ol><li>Breng 200 μg eiwit per aandoening over in een nieuwe centrifugebuis en pas aan op een eindvolume van 100 μL met chaps lyse buffer. Het is mogelijk om op te schalen tot 200 μL wanneer de eiwitconcentratie te laag is, maar vergeet niet om het volume van het verminderen/alkylating reagens op de juiste manier aan te passen.</li>
	<li>Voeg 5 μL van de 200 mM TCEP en incubaatmonsters toe bij 55 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Bereid onmiddellijk voor gebruik 375 mM iodoacetamide voor door één buis iodoacetamide (d.w.z. 9 mg) op te lossen in 132 μL van 100 mM TEAB. Bescherm deze oplossing tegen licht.</li>
	<li>Voeg 5 μL van 375 mM iodoacetamide toe aan het monster en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.</li>
</ol>5. Methanol/chloroforme neerslag20
<ol><li>Voeg 400 μL methanol toe aan elk 100 μL eiwit en kort vortexmonsters.</li>
	<li>Centrifuge bij 9.000 x g voor 10 s bij RT. Dit is om vloeistoffen die aan de zijkanten van de monsterbuis worden gedeponeerd, op te nemen.</li>
	<li>Voeg 100 μL chloroform toe aan het mengsel en kort vortex. Gebruik 200 μL chloroform als het monster een hoge concentratie fosfolipiden heeft.</li>
	<li>Centrifuge bij 9.000 x g voor 10 s bij RT. Dit is om vloeistoffen die aan de zijkanten van de monsterbuis worden gedeponeerd, op te nemen.</li>
	<li>Voeg 300 μL water en vortex krachtig toe. Het is belangrijk om een homogene oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Centrifuge op 9.000 x g gedurende 1 min bij RT. Wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat de lagen storen bij het overbrengen van de buis naar een rek. OPMERKING: De buis moet nu drie fasen bevatten: 1) Toplaag (d.w.z. supernatant), een mengsel van water en methanol; 2) Middelste laag (d.w.z. interfase), wit neergeslagen eiwit; en 3) Onderste laag (d.w.z. bodemfase), chloroform.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de supernatant.</li>
	<li>Voeg 300 μL methanol toe aan de resterende interfase- en bodemfase. Vortex krachtig.</li>
	<li>Centrifuge op 9.000 x g gedurende 2 minuten bij RT. Wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat de lagen storen bij het overbrengen van de buis naar een rek.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de supernatant.</li>
	<li>Voorzichtig aspirate zo veel vloeistof mogelijk onder een stroom van lucht (bijvoorbeeld met behulp van een vacuüm concentrator) op RT totdat de pellet is gewoon een beetje vochtig (~ 10 min). Aangezien de benodigde tijd voor elk monster anders kan zijn, controleert u elke 2 minuten om te beoordelen. Bewaar de pellet op -80 °C tot verdere verwerking.</li>
</ol>6. Eiwitvertering
<ol><li>De neergeslagen eiwitpellet opnieuw opschorten in de TEAB lysebuffer van 100 μL. LET OP: Het is optioneel om de eiwitconcentratie bij deze stap te meten.</li>
	<li>Bereid onmiddellijk voor gebruik 1 μg/μL trypsine voor door 100 μL van de trypsineopslagoplossing (50 mM azijnzuur) toe te voegen aan de bodem van de 100 μg trypsine glazen flacon en incubate gedurende 5 min in RT. Bewaar resterende reagens in doses voor eenmalig gebruik bij -80 °C.</li>
	<li>Voeg 2,5 μL trypsine per 100 μg eiwit toe. Verteren het monster 's nachts bij 37 °C. Deze stap is cruciaal voor volledige oplos van het eiwit; deze voorwaarden niet wijzigen. Na de spijsvertering is het optioneel om de eiwitconcentratie te meten met behulp van standaard eiwittesten.</li>
</ol>7. Peptide-etikettering
<ol><li>Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, equilibrate de TMT label kit reagentia naar RT.</li>
	<li>Los elk van de 0,8 mg TMT tag flacons op door de toevoeging van 41 μL watervrije acetonitril aan elke buis. Incubeer het reagens gedurende 5 minuten bij RT met af en toe vortexen. Vercentrifugeren de buizen kort. OPMERKING: Een concentratie van 0,8 mg TMT-tag is meestal voldoende om twee sets te labelen. Andere onderzoekers hebben echter aangetoond dat deze concentratie verder kan worden verminderd en nog steeds betrouwbare gegevens kan opleveren15.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 41 μL van het TMT-labelreagens toe aan elk monster van 100 μL.</li>
	<li>Broed de reactie voor 1 uur bij RT.</li>
	<li>Voeg 8 μL van 5% hydroxylamine toe aan het monster en broed gedurende 15 minuten om de reactie te blussen.</li>
	<li>Splits de monsters in gelijke hoeveelheden in een nieuwe centrifugebuis en bewaar bij -80 °C. LET OP: In deze stap zijn de monsters stabiel en kunnen ze worden ingediend voor massaspectroscopie. Het is optioneel om de concentratie op dit punt te meten met behulp van standaard eiwittesten.</li>
</ol>8. Massaspectroscopie
<ol><li>Dien de monsters in bij een proteomics-faciliteit (deze studie maakte gebruik van de UF ICBR Proteomics Core-faciliteit), waar alle monsters worden gecombineerd en gezuiverd met behulp van C18-spinkolommen. OPMERKING: Bespreek met de kernfaciliteit hoe u de monsters indienen voordat u ze voorbereidt om de exacte stappen te bevestigen die ze verkiezen voor inzendingen.</li>
	<li>Vraag de volgende procedures aan per gecombineerd multiplexmonster: vaste faseextractie, HPLC (SCX, SE), zip-tip en LC-MS/MS (2 h gradiënt voor eiwit-ID, als >10QE Plus).</li>
	<li>Zodra de gegevens zijn verzameld, zal de kernfaciliteit RAW-bestanden verwerken met behulp van door leveranciers geleverde software voor eiwitidentificatie.</li>
</ol>9. Gegevensanalyse
<ol><li>Gegevens worden meestal geleverd van de kern terug naar de gebruiker in de 7z-indeling, die kan vereisen ongeveer 16 GB schijfruimte per elke gegevensset (in dit geval 11 monsters). Controleer voor gegevensverwerking of er een computer beschikbaar is die ten minste 3,4 GHz bedraagt.</li>
	<li>Bestanden extraheren met bestandsbeheer van 7 zip. Deze uitgepakte bestanden bevatten RAW-gegevens, pdStudy-indelingsbestand en pdResultView-indelingsbestand. Bewaar alle bestanden voor verdere analyses.</li>
	<li>Open het bestand met Proteome Discovery 2.2-software. OPMERKING: De bestandsindeling is "Bestandsnaam.pdStudy". Als de 'Bestandsnaam.pdResultView' wordt geopend, is het niet mogelijk om het besturingselementvoorbeeld te selecteren.</li>
	<li>Selecteer controlemonsters op het deelvensterVoorbeelden.</li>
	<li>Open Resultaat door ID te selecteren in het deelvensterAnalyseresultaten.</li>
	<li>Exporteren naar spreadsheetsoftware.</li>
	<li>Sla ruwe gegevens op (alle geïdentificeerde eiwitten).</li>
	<li>Open het spreadsheetsoftwarebestand. Dit zal alle eiwitten bevatten die zijn geïdentificeerd.</li>
	<li>In de spreadsheet software bestand gebruik maken van de "Filter" functie om het scherm "Protein FDR Confidence: Combined" in high (kolom B), "#Unique Peptides" hoger dan 2 (kolom K), en een van " OvervloedRatio" leeg uitsluitend (kolom S tot W).</li>
	<li>Een kolom invoegen voor "p-waarde"berekening met de functie =TTEST(controlegroep, experimentele groep, staarten, type)</li>
	<li>Een kolom invoegen voor "Statistische significantie" met de functie =ALS(p-value<0,05, "Significantie","NS")</li>
	<li>Gebruik de functie" Filter" om statistische significantie tescreenenmet "Significantie". Het resultaat toont de geanalyseerde eiwitten met de statistische significantie in de controlegroep en experimentele groep.</li>
	<li>Bepaal aanzienlijk hogere of lagere eiwitexpressieovervloed in de experimentele groep in vergelijking met de controlegroep, voeg een kolom in voor "Verordening" met de functie =ALS(GEMIDDELDE(controlegroep)>GEMIDDELDE(experimentele groep),"Upregulated","Downregulated")</li>
</ol>10. Methoden om significante treffers te evalueren
<ol><li>Om eiwit-eiwit interacties tussen de significante hits geïdentificeerd in de TMT studies te identificeren, gebruik Search Tool voor het ophalen van interacterende genen / eiwitten (STRING) versie 11.021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a>
</li>
	<li>Om te classificeren naar groepen (d.w.z. moleculaire functie, biologische processen en eiwitklassen) gebruiken eiwitanalyse via Evolutionaire Relaties (PANTHER) ontologieclassificatiesoftware22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a>
</li>
	<li>Om eiwitinteracties in verschillende trajecten te identificeren, gebruikt u routeanalysesoftware23.</li>
</ol>11. Proteomic data uploaden naar een repository bank
<ol><li>Om proteomische gegevens in te dienen bij de Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) of Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE) bevatten de volgende informatie: de pieklijstbestanden (verwerkte massaspectrumbestanden in een standaardformaat zoals mzXML, mzML, of MGF), resultaatbestanden (spectrumidentificaties in een standaardformaat zoals mzIdentML of mzTab) en raw spectrum-bestanden (raw mass spectrum-bestanden in een niet-standaard of instrumentspecifiek formaat zoals . RAW-bestanden of . WIFF-bestanden).</li>
	<li>Als u wilt verzenden, maakt u een account aan en bevat u informatie zoals aansluiting en projectgegevens. Selecteer vervolgens de bestanden in stap 11.1 en upload ze.</li>
	<li>Als u een officiële gegevensset wilt maken, voert u een indieningswerkstroom uit op deze geüploade bestanden. OPMERKING: Na indiening is de gegevensset privé in de repository bank. Met de privéoptie zijn de gegevens alleen beschikbaar voor geautoriseerde gebruikers. Er zijn twee extra opties: 1) Gedeelde gegevensset, die toegang geeft tot tijdschriftbeoordelaars en bijdragers; of 2) Openbare gegevensset, die wordt weergegeven in openbare gegevenssetzoekopdrachten. Een ander belangrijk kenmerk van deze repositories is de mogelijkheid om de geüploade gegevens bij te werken en volgende publicaties te koppelen aan de bestaande gegevensset.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li><li>Rabilloud, T., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+a+tutorial.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial.</a> Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis:+Past,+present+and+future.">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li><li>Haynes, P. A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+profiling-pitfalls+and+progress.">Proteome profiling-pitfalls and progress.</a> Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).</li><li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives.">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li><li>Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILAC+fly+allows+for+accurate+protein+quantification+in+vivo.">The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).</li><li>Zhang, G., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC)+for+phosphotyrosine+protein+identification+and+quantitation.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC-based+quantitative+MS+approach+for+real-time+recording+protein-mediated+cell-cell+interactions.">SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics.">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li><li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+Tandem+Mass+Tag+(SL-TMT)+Protocol:+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+(Phospho)proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3.">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+Labeling+for+the+Masses:+A+Robust+and+Cost-efficient,+In-solution+Labeling+Approach.">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics.">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701 (2019).</li><li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome.">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels.">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).</li><li>Wessel, D., Fl&#252;gge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li><li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms.">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li><li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants.">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).</li><li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes.">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li><li>Ryan, B. J., Henehan, G. T., Walls, D., Loughran, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Chromatography: Methods and Protocols. , 53-69 (2017).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om monsters met succes voor te bereiden op proteomische analyse met behulp van isobarische isobarische isobarische isotopenealkeuringsmethoden op basis van TMT, is het van cruciaal belang om eiwitextracties zeer zorgvuldig uit te voeren bij 4 °C en een lysebuffer te gebruiken die een proteaseremmercocktail24,25bevat . De protease inhibitor cocktail is een cruciaal reagens om onverwachte eiwitafbraak tijdens eiwitvertering te voorkomen. Een belangrijk verschil tussen ons protocol en het huidige protocol van de leverancier is dat we het gebruik van CHAPS lyse buffer sterk aanbevelen op basis van onze ervaring met zoogdiercellen en weefsels. We raden ook aan om een methanol/chloroforme eiwitneerslagbenadering te gebruiken voor zowel celpellets als weefsels.
Idealiter worden eiwitextractie, meting, vermindering/alkylating reagensbehandelingen en methanol/chloroforme neerslag allemaal op dezelfde dag uitgevoerd. Na deze aanbeveling zal resulteren in nauwkeurigere eiwitconcentraties voor latere etikettering. De eiwitnecipitatiestap is belangrijk voor het verwijderen van reagentia die de tandemmassaspectrometrie verstoren. Inclusief de neerslagstap verbetert de resolutie van TMT26aanzienlijk. Kortom, de belangrijkste voordelen van ons TMT-protocol zijn de hoge etiketteringsefficiëntie voor verschillende soorten monsters, de reproduceerbaarheid en de betrouwbare verkregen gegevens.
Aangezien de multiplex aard van deze TMT ongerichte proteomics strategie blijft uitbreiden, zal het geleidelijk verbeteren van het vermogen van onderzoekers over een breed scala van gebieden om nieuwe ontdekkingen te doen. Specifiek op biomedisch gebied, hebben wij en anderen deze technologie steeds informatiever gevonden in studies die nieuwe werkingsmechanismen in ziekte en relatieve effecten van diverse therapeutica onderzoeken. Om al deze redenen vormt deze krachtige technologie een aanvulling op het repertoire van andere OMICS-benaderingen die in moderne onderzoeken worden gebruikt en biedt belangrijke informatie die verdere therapeutische ontwikkeling kan sturen.

De term "proteomics" werd voor het eerst gedefinieerd als de grootschalige karakterisering van de gehele eiwitaanvulling van een cel, weefsel of organisme1. Proteomische analyses maken het mogelijk mechanismen en cellulaire processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, therapeutische trajecten en gezonde systemen met behulp van technieken om relatieve kwantificering van eiwitexpressie niveaus uit te voeren2. De eerste beschrijvingen van dergelijke studies werden gepubliceerd in 1975 en toonden het gebruik van tweedimensionale polyacrylamide gel elektroforese (2D-PAGE) voor dit doel1,3. De 2D-methode scheidt eiwitten op basis van lading (isoelectrische scherpstelling, IEF) en moleculaire massa (natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese, of SDS-PAGE)4. Jarenlang was de combinatie van 2D-PAGE en de daaropvolgende tandemmassaspectrometrie op elke gelcomponent de meest voorkomende ongerichte eiwitexpressieanalysetechniek die werd uitgevoerd en identificeerde talrijke voorheen onbekende eiwitexpressieprofielen5,6. Algemene nadelen van de 2D-PAGE benadering zijn dat het tijdrovend is, niet goed werkt voor hydrofobe eiwitten, en er zijn beperkingen in het totale aantal eiwitten beoordeeld als gevolg van lage gevoeligheid7,8.
De stabiele isotoop etikettering door aminozuren in de celcultuur (SILAC) methode werd de volgende populaire aanpak te identificeren en kwantificeren eiwit overvloed in monsters9. Het bestaat uit metabolische etikettering van cellen die zijn geïncubeerd in medium ontbreekt een standaard essentieel aminozuur en aangevuld met een isotoop-gelabelde versie van dat specifieke aminozuur10. Het voordeel van deze techniek is de efficiëntie en nauwkeurige etikettering9. De belangrijkste beperking van de SILAC-benadering is in de eerste plaats de verminderde celgroei die wordt veroorzaakt door de integratie van isotopenlabels, wat bijzonder uitdagend kan zijn in relatief gevoelige cellijnen die menselijke ziekten modelleren11.
In 2003 werd een nieuwe en robuuste proteomics techniek met tandem mass tag (TMT) isobaric labels geïntroduceerd op het veld12. TMT-etikettering is een krachtige methode vanwege de verhoogde gevoeligheid voor het detecteren van relatieve eiwitexpressieniveaus en posttranslationele modificaties13. Vanaf deze publicatiedatum zijn TMT-kits ontwikkeld die tegelijkertijd 6, 10, 11 of 16 monsters kunnen labelen. Als gevolg hiervan is het mogelijk om peptide overvloed te meten in meerdere omstandigheden met biologische repliceert op hetzelfde moment14,15,16. We hebben onlangs TMT gebruikt om het cardiale proteomische profiel van een muismodel van Barth Syndroom (BTHS)17te karakteriseren. Daarbij konden we een wijdverbreide verbetering van de hartprofielen van BTHS-muizen die met gentherapie werden behandeld, aantonen en nieuwe eiwitten identificeren die werden beïnvloed door BTHS, die nieuwe therapeutische paden onthulden die betrokken waren bij cardiomyopathieën.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om multiplex TMT kwantitatieve proteomics analyses uit te voeren met behulp van weefselmonsters of celpellets. Het kan nuttig zijn om de monstervoorbereiding en etikettering uit te voeren voordat ze aan een kern worden ingediend, omdat de gelabelde tryptische peptiden stabieler zijn dan ruwe bevroren monsters, niet alle kernen hebben ervaring met het hanteren van alle monstertypen, en het voorbereiden van monsters in een laboratorium kan tijd besparen voor kernen, die vaak lange achterstanden hebben. Voor gedetailleerde beschrijvingen van het massaspectroscopiegedeelte van dit proces raadpleegt u Kirshenbaum et al. en Perumal et al.18,19.
Het monsterpreparaat bestaat uit de volgende belangrijke stappen: extractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering en etikettering. De belangrijkste voordelen van dit geoptimaliseerde protocol zijn dat het de kosten van etikettering verlaagt, de eiwitextractie verbetert en consequent gegevens van hoge kwaliteit genereert. Daarnaast beschrijven we hoe we TMT-gegevens kunnen analyseren om duizenden eiwitten in korte tijd te screenen. We hopen dat dit protocol andere onderzoeksgroepen aanmoedigt om te overwegen deze krachtige methodologie in hun studies op te nemen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Proteomische technologieën zijn krachtige methoden die ons begrip van de werkingsmechanismen in biologische systemen kunnen helpen door een globaal beeld te geven van de impact van een ziekte, behandeling of andere aandoening op het proteoom als geheel. Dit rapport bevat een gedetailleerd protocol voor de extractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering en daaropvolgende gegevensanalyse van eiwitmonsters. Ons geoptimaliseerde TMT-labelingprotocol vereist een lagere tag-labelconcentratie en bereikt consistent betrouwbare gegevens. We hebben dit protocol gebruikt om eiwitexpressieprofielen te evalueren in een verscheidenheid aan muisweefsels (d.w.z. hart, skeletspieren en hersenen) en cellen gekweekt in vitro. Daarnaast laten we zien hoe we duizenden eiwitten uit de resulterende dataset kunnen evalueren.

Gezonde en zieke cellen werden gelysed in CHAPS buffer, bereid zoals beschreven in onze TMT labeling methode, en voorgelegd aan de Universiteit van Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (UF-ICBR) Proteomics Core voor Vloeibare Chromatografie met tandem massa spectrometrie. Na het verkrijgen en leveren van gegevens vanuit de kern werd de dataset geopend in door leveranciers geleverde software en werden de volgende cutoff-filters toegepast: ≥2 unieke peptiden, reporterionen voor elk eiwitmonster dat in alle kanalen aanwezig is, en omvatten slechts aanzienlijk gewijzigde eiwitten (p ≤ 0,05). Tabel 1 vat de gegevens samen: 39.653 in totaal peptiden, waarvan 7.211 gelijk of groter zijn dan twee unieke peptiden, en 3.829 bevatten reporter ionen voor alle kanalen. De p-waarden voor deze 3.829 peptiden werden berekend door de t-test van de student en p ≤ 0,05 werd als significant beschouwd. Daarnaast werd een fold-change cutoff gebruikt om de relatieve verdeling van eiwitten uit zieke eiwitten te bepalen in vergelijking met gezonde cellen: downregulated (blauw) of upregulated (rood) (Figuur 1).
De lijst van significant onreglementeerde eiwitexpressie werd beoordeeld aan de hand van het PANTHER ontologieclassificatiesysteem en STRING-analyses. Panther analyses toonden een gecategoriseerde lijst van eiwitten op basis van aanzienlijk lager (Figuur 2A) of een hogere overvloed in zieke cellen op basis van moleculaire functie (Figuur 2B). String analyses van eiwitten van aanzienlijk lager (Figuur 2C) en hoger (Figuur 2D) overvloed geïdentificeerd meerdere interacties en sterke associaties tussen eiwitten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Figuur 1: Vulkaan plot met eiwitten waarvan de overvloed niet significant was veranderd (zwart), aanzienlijk verlaagd (blauw), of aanzienlijk toegenomen (rood) in zieke vs gezonde controlecellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Figuur 2: Representatieve evaluaties van aanzienlijk gedysreguleerde hits geïdentificeerd door PANTHER (A, B) en String (C, D) van aanzienlijk lagere of hogere overvloed eiwitten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totaal peptiden</td>
			<td>Totaal geïdentificeerd</td>
			<td>≥ 2 unieke peptiden</td>
			<td>Gekwantificeerde eiwitten</td>
			<td colspan="2">Aanzienlijk gewijzigde eiwitten</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lage</td>
			<td>Hoge</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Representatieve tabel van gekwantificeerde eiwitten per dataset-analyse.

Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn dat het de kosten van etikettering verlaagt, de eiwitextractie verbetert en hoogwaardige gegevens genereert. De belangrijkste voordelen van ons protocol zijn de hoge etiketteringsefficiëntie voor de verschillende soorten monsters, de reproduceerbaarheid en de betrouwbare gegevensverwerving. Na het isoleren van quadriceps spierweefsel monsters van een geëuthanaseerde muis volgens een IACUC goedgekeurd protocol, wegen 10 milligram spierweefsel en gebruik pincet om de spiervezels te scheiden.Om een lysaat te maken, breng je het gescheiden weefselmonster over in een twee milliliter buis met 200 microliter van een millimeter zirconia silica kralen en 500 microliters chaps lysis buffer. Plaats de monsters in een kraalvers disruptor en voer twee opeenvolgende runs van 45 seconden uit. Na de tweede cyclus, om het DNA-gebonden eiwit vrij te geven, sonisch het monster 10 keer gedurende 10 seconden per sonicatie op een 50%amplitude met intervallen van 30 seconden op ijs.Na de laatste sonicatie, centrifugeren het lysaat en breng de supernatant naar een nieuwe centrifuge buis. Voor het verminderen/alkyleren van reagensbehandeling breng je 200 microgram eiwit per conditie over in nieuwe centrifugebuizen en gebruik je een verse CHAPS lyse buffer om het uiteindelijke volume in elke buis tot 100 microliters te brengen. Voeg vervolgens vijf microliter TCEP toe aan elke buis en broed de monsters een uur lang uit op 55 graden Celsius.Los aan het einde van de incubatie negen milligram iodoacetamide op in 132 microliter van 100 millimolar TEAB en bescherm de resulterende 375 millimolar iodoacetamideoplossing tegen licht. Voeg vervolgens vijf microliter iodoacetamide toe aan elk monster en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voor methanol/chloroforme neerslag, voeg 400 microliter methanol aan elke 100 microliter eiwit en kort vortex de monsters.Om de vloeistoffen die aan de zijkanten van de monsterbuizen worden afgezet, op te nemen, worden de monsters kort gecentrifugeerd en 100 microliter chloroform aan elke buis toegevoegd. Na een korte vortexing, snel centrifugeren de buizen weer om de vloeistof te verzamelen aan de zijkanten van de buizen en voeg 300 microliters van water aan de monsters. Vortex krachtig om homogene oplossingen te verkrijgen en centrifugeren de monsters gedurende een minuut onder dezelfde centrifuge voorwaarden.Breng de buizen aan het einde van de centrifuge voorzichtig over in een rek zonder de lagen te storen en verwijder de supernatant voorzichtig. Voeg 300 microliter methanol toe aan de resterende inter- en bodemfasen en draaivorst de monsters weer krachtig. Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten en pireer de supernatants zorgvuldig aan.Dan voorzichtig aspirate zo veel vloeistof uit elk monster mogelijk onder een stroom van lucht tot de pellets zijn gewoon een beetje vochtig. Beoordeel de hydratatie om de twee minuten gedurende ongeveer 10 minuten. Indien nodig kunnen de pellets worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking.Om het eiwit te verteren, resuspend de neergeslagen pellet in 100 microliters van TEAB lyse buffer en voeg 100 microliters van trypsine opslag oplossing aan de onderkant van een 100 microgram trypsine glas flacon. Voeg na vijf minuten bij kamertemperatuur 2,5 microliter van de vers bereide trypsineoplossing per 100 microgram eiwit toe aan elk monster en broed de monsters 's nachts bij 37 graden Celsius uit. Los voor peptide-etikettering elke 0,8 milligram TMT-tag flacon op met 41 microliter watervrije acetonitril per tag en ontcubeer de reagentia gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe vortexen terwijl de etiketten tegen licht worden beschermd.Aan het einde van de incubatie, kort centrifugeren de flesjes en zorgvuldig 41 microliters van TMT label reagens toe te voegen aan elk 100 microliter monster voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, blus de reacties met de toevoeging van acht microliters van 5%hydroxylamine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens splitsen de monsters in gelijke aliquots in nieuwe centrifuge buizen voor opslag bij min 80 graden Celsius.In deze representatieve gegevensverwerving werden 39, 653 in totaal peptiden geanalyseerd, waarvan er 4, 457 gelijk hadden aan of groter dan twee unieke peptiden en 3, 829 opgenomen reporter ionen voor alle kanalen. Een vouw verandering cutoff werd gebruikt om de relatieve verdeling van eiwitten uit zieke in vergelijking met gezonde cellen met 296 eiwitten van aanzienlijk lagere overvloed en 108 eiwitten van aanzienlijk hogere overvloed waargenomen te bepalen. PANTHER analyse toonde een gecategoriseerde lijst van eiwitten op basis van aanzienlijk lagere of hogere overvloed aan zieke cellen op basis van hun moleculaire functie.De analyse van de koord van de proteïnen van beduidend lagere of hogere overvloed identificeerde verder veelvoudige interacties en sterke verenigingen tussen proteïnen. Aanvullende methoden kunnen worden uitgevoerd om eiwit-naar-eiwit interacties te identificeren, om de interacties te classificeren door groepen, en om de interacties in een verscheidenheid van trajecten te identificeren. Proteomics technieken zijn krachtige instrumenten binnen de biomedische onderzoeksvelden voor het begrijpen van de mechanismen van ziekteontwikkeling door het verstrekken van gedetailleerde eiwit overvloed informatie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...