뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애의 주요 원인입니다. 혈전용및 뇌혈관 폐색의 외과적 제거는 일부 환자에서 수행될 수 있지만, 뇌졸중에 대한 효과적인 치료법이 여전히 절실히 필요하다. 여기서, 우리는 뇌졸중 치료를 위한 잠재적인 처방으로서 허혈성 반구에 줄기 세포의 카테터 기반, 동맥 내 전달을 시연한다.
먼저, 주사 카테터와 수술 후크를 준비하는 방법을 소개합니다. 우리는 동맥 내 주입을 위한 주사 카테터의 두 가지 유형을 설계했습니다. 설계 하나는 튜브의 플러싱이 필요하지 않은 용액 또는 서스펜션의 주입에 사용됩니다.
디자인 2는 신경 줄기 세포의 주입을 허용하고, 죽은 부피의 플러시다음 전체 볼륨을 전달할 수 있습니다. 사출 카테터 세트를 구축하려면 26 게이지 및 20 게이지 바늘, MRE 25 카테터의 10 ~ 15 센티미터 길이및 MRE 50 및 MRE 10 카테터의 3 센티미터 길이가 필요합니다. 바늘 끝을 잘라 내고 사포에 금속 끝을 연마하여 튜브를 다시 열고 가장자리를 부드럽게 한 다음 증류수로 씻어 내어 구멍을 청소하고 이물질을 씻어냅니다.
그림은 바늘 끝을 잘라 낸 후 20 게이지 바늘의 닫힌 끝을 보여 주며 연마 후 부드러운 보어로 다시 열립니다. 현미경으로, MRE 50 튜브의 끝에 20 게이지 바늘을 삽입. 26 게이지 바늘을 구부리고 20 게이지 바늘 끝의 끝 아래에 튜브를 관통합니다.
슈퍼 접착제로 26 게이지 바늘을 고정하십시오. 그런 다음 두 개의 바늘 허브와 튜브 및 에폭시를 포함시켜 강도를 향상시키기 위해 견고한 블록을 구축합니다. 또한 수술 부위의 더 나은 노출을 위해 조직을 제자리에 고정시키기 위해 세 가지 수술 후크가 필요합니다.
27 게이지 바늘에서 1 센티미터 반에서 2 센티미터 길이의 바늘 샤프트를 자르고 사포에서 양 끝을 칙칙할 때까지 연마합니다. 작은 혈전성 클램프를 사용하여 샤프트를 한쪽 끝에 후크로 구부리고 다른 쪽 끝에는 링 모양이 있습니다. 10~15센티미터 길이의 MRE 25 카테터를 링을 통해 삽입하고 명확한 수술 용 테이프로 고정하십시오.
동일한 방법을 사용하여 두 개의 후크를 더 만듭니다. 후크와 카테터 시스템은 멸균을 위해 70%의 에탄올에 밤새 담가야 합니다. 동물 과목과 관련된 모든 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
우리는 GFP, 양성 신경 줄기 세포를 배양하기 위해 ENT 배아 마우스 뇌를 사용합니다. GFP 양성 배아는 형광 현미경에 FITC 채널에서 쉽게 시각화될 수 있다. 야생 형 배아는 동일한 노출을 사용하여 형광을 보이지 않습니다.
야생형 배아의 자가발성은 노출 시간이 100배 증가할 때만 볼 수 있습니다. 배아 피질은 제조업체의 프로토콜에 따라 신경 줄기 세포 배양을 확립하기 위해 수집되고 사용됩니다. 이 신경 줄기 세포는 신경구를 형성할 수 있고 10 세대 이상 통과될 수 있고 glia로 분화할 수 있는 신경세포는 신경세포입니다.
나노그, SSEA1, Oct4 및 Sox3와 같은 배아 줄기 세포 마커의 패널은 신경구에있는 동안 줄기 세포 특성을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 신경구는 제조자의 프로토콜에 따라 미디어에서 배양되었고 신경 줄기 세포 전달을위해 3 및 5 통로 사이에 사용되었습니다. 허혈성 뇌졸중은 종에 따라 일부 수정과 필라멘트 기반, 중간 뇌동맥 폐색, MCAO를 사용하여 마우스와 쥐 모두에 대한 왼쪽 반구에서 유도되었다.
마우스에서 필라멘트는 일반적인 경동맥, CCA를 통해 삽입되고 내부 경동맥, ICA로 진행된다. 쥐에있는 동안, 필라멘트는 외부 경동맥을 통해 도입, 더 큰 작업 공간 때문에 ICA로 ECA. 여기에서 우리는 마우스 수술을 시연합니다.
목을 따라 중간 선 절개를 한 후 무딘 해부를 사용하여 기본 조직을 분리합니다. 더 나은 시야를 달성하기 위해 27 게이지 바늘 샤프트로 만든 세 가지 미세 수술 후크를 사용합니다. 검은 색 사각형은 다음 단계에 대한 수술 영역을 나타냅니다.
왼쪽 CCA 위의 근육 층은 왼쪽 CCA및 미주 신경을 노출하기 위해 조심스럽게 열려 있습니다. 분기에 도달하고 식별할 때까지 CCA를 따르십시오. 이 CCA 또는 미주 신경을 스트레칭, 변위 또는 짜내지 않도록 주의해야 합니다.
CCA와 미주 신경을 덮고 있는 명확한 결합 조직을 조심스럽게 엽니다. 집게 의 끝으로이 CCA 아래에 공간을 확보하고 가능한 한 CCA 줄기를 분리. CCA 아래에 이중 좌초 된 6 개의 O 편조 나일론 수술 봉합사를 스레드.
중간 점을 잘라 CCA의 기본 봉합사에 둡니다. CCA 아래에 또 다른 나일론 봉합사를 놓습니다. 상단 봉합사에 슬립노트를 묶어 느슨하게 유지합니다.
두 개의 하부 봉합사를 분리합니다. 중간 봉합사에 슬립 매듭을 묶어 지금은 느슨하게 유지합니다. 하부 봉합사로 외과 의사의 매듭을 묶고 가능한 한 근위 끝으로 이동합니다.
봉합사 끝을 잘라내면 됩니다. 또한 분기 를 넘어 CCA를 노출. 상부 느슨한 슬립노트를 분기로 밀어 혈액의 역류를 방지하기 위해 조이십시오.
실리콘 고무 코팅 70 나일론 MCAO 봉합사를 CCA 옆에 놓습니다. 마이크로 가위를 사용하여 아래 매듭 옆에 있는 CCA의 작은 절개를 자른다. MCAO 봉합사의 끝을 CCA에 삽입하여 이 절개를 통해 상부 매듭으로 진행합니다.
중간 매듭의 위치를 조정하고 위치에 MCAO 봉합사를 보유 할 수 있습니다 때까지 조여. 매듭을 과도하게 조이지 마십시오. 상부 매듭을 놓지만 같은 위치에서 또 다른 느슨한 슬립 매듭을 만듭니다.
MCAO 봉합사를 ICA로 진행합니다. MCAO 봉합사가 ICA로 분기를 전달확인합니다. 봉합사의 경로는 상대적으로 똑바로해야, 그것은 발전으로 조직에 깊은 입력.
봉합사 끝에 있는 실버 마커를 확인합니다. 분기에 도달했는지 확인합니다. MCAO 봉합사의 방향을 다시 확인합니다.
혈액 누출을 보장하기 위해 상부 및 중간 매듭을 조정합니다. MCAO 봉합사를 한층 더 진행하고, 두 개의 상부 매듭을 조여 MCAO 봉합사를 제자리에 고정시합니다. 허혈의 한 시간 동안 녹화 시간을 시작합니다.
허혈의 한 시간 후, 우리는 동물을 마취하고 피부 상처를 다시 엽니 다. 수술 부위를 노출합니다. 위쪽 및 중간 슬립노트를 찾습니다.
윗매듭을 부드럽게 놓습니다. 흰색 실리콘 고무 부분이 중간 매듭에 도달 할 때까지 MCAO 봉합사를 부드럽게 당깁니다. 출혈을 피하기 위해 MCAO 봉합사를 제자리에 고정하기 위해 상부 매듭을 조입니다.
중간 슬립노트를 부드럽게 놓습니다. MCAO 봉합사를 당겨 끝이 위 매듭을 지나갈 때까지 당깁니다. 상부 매듭을 조입니다.
CCA의 절개 바로 위에 중간 슬립노트를 놓습니다. 중간 슬립노트를 조입니다. 위 매듭을 제거합니다.
중간 매듭의 봉합사 끝을 잘라. 피부 상처를 닫고 동물이 회복되도록 하십시오. 우리의 경험에 따라, 신경 줄기 세포는 뇌졸중 후 1 ~ 3 일 사이의이 동맥 경로를 통해 안전하게 주입.
다시 말하지만, 신경 줄기 세포 주입을위한 마우스와 쥐 수술 사이에 약간의 변화가 있습니다. 그리고 여기에 우리는 마우스 수술을 보여줍니다. 뇌졸중 후 3일째에 동물을 마취시키고 상처를 다시 열고 CCA를 다시 노출시합니다.
CCA 아래에 이중 좌초 수술 봉합사를 놓고 중간점에서 잘라 두 봉합사를 얻습니다. 두 봉합사를 올바르게 놓습니다. 상부 봉합사와 함께 슬립노트를 만듭니다.
분기 바로 아래에 놓습니다. 상단 슬립노트를 조입니다. 중간 봉합사로 또 다른 슬립노트를 만듭니다.
뇌졸중 수술에서 남은 손질된 매듭 바로 위에 작은 절개를 잘라냅니다. MRE 10 카테터의 끝을 약 45도 각도로 다듬습니다. 이 날카로운 끝을 사용하여 CCA의 절개를 입력합니다.
카테터를 삽입하는 데 사용되는 진입 각도와 힘을 적절하게 조정하십시오. 그렇지 않으면 카테터가 CCA에 들어가지 않거나 구멍을 뚫을 수 있습니다. 카테터를 삽입하고 팁이 위 매듭에 도달 할 때까지 진행합니다.
중간 슬립노트를 조여 카테터를 제자리에 고정시키고 혈액 연계가 없도록 합니다. 위 매듭을 놓습니다. 상부 봉합사로 슬립 매듭을 만듭니다.
CCA 내의 카테터 각도와 혈액의 빠른 역류가 보일 때까지 두 매듭의 위치를 조정하여 카테터와 CCA 흐름 간의 성공적인 통신을 나타냅니다. 주사기 펌프를 시작합니다. 카테터의 혈액은 CCA로 다시 플러시됩니다.
5 분 후에 주입을 종료합니다. 상단 매듭을 리게이트합니다. 중간 매듭을 해제하고 카테터를 철회합니다.
중간 매듭을 리게이트합니다. 모든 매듭을 다듬습니다. 상처를 닫고 동물이 회복되도록 하십시오.
동맥 내 주입에 이어, GFP 표지 신경 줄기 세포는 주로 ipsilateral 반구에서 발견된다. 여기서, 우리는 주입 후 하루에 해마 의축 자이루스의 분포를 보여줍니다. 입각 반구에서, 일부 GFP 양성 신경 줄기 세포는 피질과 줄무늬에 국한되어, 이중 피질, 미숙한 뉴런의 마커를 표현한다.
이들은 주입 후 7 일 동안 신경 줄기 세포 주입이 있거나없는 가짜 및 뇌졸중 동물의 대표적인 이미지입니다. 납품 후 30일 후에, 차량 주사를 받는 동물의 FITC 채널을 통해 경미한 자동 형광만 검출될 수 있다. 줄기 세포주입 동물에있는 동안, GFP 표지 신경 줄기 세포는 글리오 마커 GFP 또는 신경 마커 tujuan 같은 다양한 세포 마커의 발현과 부상당한 뇌에서 찾을 수 있습니다.
각 이미지의 백색 화살표는 각각 GFP 또는 tujuan 마커를 표현하는 신경 줄기 세포를 표시합니다. 결론적으로, 동맥 내 주사는 뇌졸중 치료를 위한 신경 줄기 세포의 전달을 위한 실행 가능한 방법입니다. 신경 줄기 세포는 생존하고 부상당한 두뇌 내의 다른 세포 모형으로 분화할 수 있습니다.
그리고 마지막으로, 여기에 소개된 동맥 내 주입 방법은 또한 솔루션 및 현탁액의 전달에 사용될 수 있다.
