우리는 머리 플레이트 디자인을위한 박사 Maiken Nedergaard을 (로체스터 의료 센터의 대학) 감사합니다. 작품은 SD (R01DA026325 및 P30AI078498와 주식 회사 (다나 재단의 두뇌와 Immunoimaging 프로그램, 미국 심장 협회 0635595T와 ALS 협회 [# 1112)]에 기초 보조금)에 NIH 보너스에 의해 지원되었습니다.

1. 이미징을위한 동물의 준비 참고 : 우리는 성인 c57BL 마우스를 사용합니다. 서로 다른 유전자 변형 종자는 연구 질문에 따라 사용할 수 있습니다. Microvascular 수술 및 펄스 oximetry은 흰색 모피와 생쥐 (예 FVB 스트레인)에 용이합니다. <ol><li> 벤치에서 외과 사이트를 준비합니다. 모든 수술 장비는 70 % 에탄올로 autoclaved하거나 소독해야합니다. </li><li> 직장 프로브를 삽입하고 지속 절차 전반에 걸쳐 동물의 체온을 측정 </li><li> 처음에 5 % isoflurane을 사용 마우스를 마취. 15-30의에서 동물이 이동하지 않는 경우, 손난로 (37 ° C)에 배치하고, isoflurane 1.3-1.5 %)를 포함하는 공기의 지속적인 제공을위한 얼굴 마스크를 적용합니다. 동물이 통증 자극 (예 : 꼬리 핀치)에 응답하지 않았는지 확인합니다. </li><li> 건조한 공기에 노출을 막기 위해, 마우스의 시선을 충당하기 위해 인공 눈물 젤을 사용하십시오. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 헤어 F를 제거롬 머리와 양쪽 허벅지에서. 2 분의 허벅지에 머리 제거제 (예 : 나이르) 적용하고 나머지 머리를 제거 조심스럽게 닦아냅니다. 이 허벅지는 oximetry에 사용됩니다. </li><li> 10 % povidone-요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독. </li></ol> 2. 열린 두개골 두개골 창 준비하기 <ol><li> 두개골에 꼬리 5mm 시작하면 가위로 두피에 절개를하고, 일cm을 부활시켰습니다. 두개골을 노출 언저리 피부를 이동합니다. </li><li> 두개골 위에 세포막을 제거하기 위해서는 두개골의 맨 10 % 산화철 염화물 솔루션을 적용합니다. 과잉 솔루션을 닦아하고, 45 ° 각도 # 5 핀셋으로 멀리 세포막을 다쳤어요. 그것은 머리에 접시가 안전 (단계 # 4-6) 두개골에 장착할 수 있도록하기 위해 신중하게 사이트를 준비하는 것이 중요합니다. </li><li> 해부 현미경 사용하여 관심 영역을 식별합니다. 두개골 봉합은 피해야한다합니다 인해 두개골 C다음 행과 함께 예측할하다. </li><li> 머리 접시의 창 (그림 1)의 가장자리 주위에 빠른 접착제의 얇은 레이어 (예 Locktite 454)을 적용합니다. 관심 지역 창에 노출되는 등의 방법으로 헤드 플레이트를 둡니다. 헤드 접시 빛의 압력을 적용합니다. 급속하게 접착제를 중합하는 치과용 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. 접착제가 polymerizing하는 동안 10 초 동안 잡아. </li><li> 머리 판과 두개골을 봉인하기 위해 창의 가장자리로 빠른 접착제의 작은 금액을 적용합니다. 절개 범위 하에서 동물의 소유자로 머리 판 치고. </li><li> 6,000 RPM 및 IRF 005 드릴 비트에서 설정 Microtorque II 드릴을 사용하여 두개골에서와 헤드 플레이트의 모든 여분의 접착제를 제거합니다. 이것이 달리 유리 커버의 부착을 방해하므로 헤드 판에 남아있는 접착제가 제거되어야합니다. </li><li> 1,000 rpm으로 드릴을 설정하고, 지름 ~ 5 m의 헤드 플레이트 창 내부에 원을 만들어 두개골을 뚫는 시작줄게. 당신은 아주 부드러운 연필로 드로잉하는 것처럼 빛을 전면 움직임을 사용합니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 뚫는 중지합니다. 참고 : 헤드 플레이트의 구멍의 모양은 원형 두개골 창을 만들 쉽게 드릴 비트 (왼쪽 및 오른쪽 손으로 외과 의사에 대한)에 대한 추가 액세스하실 수 있습니다. 또한, 두 이상한 모양의 구멍은 추가 polarographic 또는 electrophysiological 측정 두개골 창 아래에 뇌 조직으로, 클락 - 전극이나 유리 전극을 삽입하기 위해 필요한 공간을 제공합니다. </li><li> 시추가 진행되면서 뚫으는 중앙의 손상 두개골 주위에 형성됩니다. thinned 두개골을 통해 찌를하지만, 설령 두께의이 뚫으을하지 않도록주의하십시오. 대형 혈액 혈관 - 그들이 타협하지 않으며, 가능한 경우도 건드리지 않았어야 주위에 여분주의하십시오. </li><li> 윈도우의 중앙에 ( &quot;탁 끄다&quot;) 뼈 올려 핀셋 # 3 중 하나 &quot;다리&quot;를 사용합니다. artific 한 방울을 적용창문에 ial 뇌척수 (aCSF). </li><li> 부드럽게 부드러운 조직 종이 모서리를 (예 : Kimwipe)를 사용 aCSF를 닦아주십시오. 보통 경질은 창의 가장자리 주위에 하나 이상의 장소에서 손상되었습니다. 이러한 사이트 중 하나에서 시작은 부드럽게 들어올리 다음 45 ° 각도 핀셋 # 5를 사용하여 뇌 표면에서 경질을 제거합니다. 경질을 제거하기 시작하기에서 사이트를 선택하면, 큰 혈관에 인접한 지역을 피하십시오. 출혈이 발생하면 aCSF 한 방울을 적용하고 막을 경미한 출혈에 대해 2-3 분 기다립니다. </li><li> 0.07 %의 낮은 용융 aCSF에 녹아있는 아가로 오스)이 체온에 녹아 아가로 오스 가져와 준비합니다. 뇌의 표면에서 aCSF의 초과 멀리 닦아주십시오. 윈도우에서 아가로 오스를 붓고, 그리고 유리 슬라이드와 커버. 유리와 헤드 플레이트 사이의 접촉을 만들기 위해 부드럽게 유리를 눌러 아가로 오스는 고체 때까지 10-20 초 정도 기다리십시오. </li><li> 핀셋과 부드러운 티슈를 사용하여 유리 커버에서 초과 아가로 오스를 제거합니다. </li><li> 작은 넣고접착제 헤드 판에 유리로 유리 주위 급속한 접착제의 금액입니다. 접착제 (그림 1)을 고체화하기 위해 치과 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. </li></ol> 3. 정맥 주사와 혈액 산소 모니터링 참고 : 우리는 일상적으로 정맥 주사 텍사스 적색의 응용보다는 꼬리 정맥에 대한 대퇴 정맥을 사용. 대퇴 정맥 주사는 염료의 안전하고 재현성 bolus 주사를 제공하기 때문입니다. <ol><li> 부분적으로 왼쪽 허벅지 안쪽을 폭로를 통해 동물을 켭니다. 이 자세로 동물을 보호하기 위해 테이프를 사용하십시오. </li><li> 살균 스크럽 후 피부에 100 % 에탄올을 적용합니다. </li><li> 무릎에서 치골 symphysis로 내측 허벅지를 따라 절개를합니다. 족집게 # 5를 사용 무딘 절개로 구분 부드러운 조직. </li><li> 텍사스 레드 (2.5 밀리그램 / ML) 130 μl로 1ml 주사기를 채우십시오. 새로운 바늘 (30 게이지) 첨부하고, 베벨을 유지, 30 °에서 신중하게 그것을 구부. 바늘 WI를 채우일 텍사스 레드 솔루션입니다. </li><li> 해부 현미경에서 대퇴 정맥에 바늘을 삽입하고 텍사스 레드 100 μl를 주입. 바늘을 제거하고 가볍게 출혈을 멈추게하기 위해 거즈로 정맥을 누르십시오. </li><li> 4-0 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 혈액 SpO 2의 지속적인 모니터링 (적절한 혈액 산소를 보장하기 위해) 허벅지 (있는 머리는 이전에 제거되었다)에 산소 농도계 프로브를 배치하십시오. </li></ol> 4. 두 광자 이미징 참고 : 여기 소스로 사 레이저 : 우리는 스펙트럼 - 물리 MaiTai HP DeepSee femtosecond 티가있는 올림푸스 Fluoview1000 multiphoton 이미징 시스템 (직립)을 사용합니다. 이미징 들어, × 10 NA 0.45 (자이스 혈구는 C-고차 색지움) 또는 × 25 NA 1.05 (올림푸스 XLPlan N) 물에 침지 목표를 사용합니다. 우리는 512의 해상도 × 픽셀과 512 픽셀 2 μs의 시간을 머물러에서 12 비트 심도에서 이미지를 가져가라. NADH와 텍사스 - 레드-dextran은 동시에 740 nm의에서 흥분하고, 형석있다escence은 이색성 거울 / 니어 IR-차단 필터 조합을 사용하여 여기 빛으로부터 분리합니다 (FF665-Di01을, FF01-680/SP, Semrock, 로체스터, 뉴욕, 미국)이 이색성 거울을 사용하여 두 개의 채널로 나누어 (505DCXRU, 채도 , Rockingham, 버몬트, 미국), 그리고 대역 통과는 (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36) 필터링. 객관적 후 측정된 레이저 파워 레이어 전의 이미지와 레이어 II의 이미징을위한 20-50 MW를위한 10-20 MW했습니다. <ol><li> 현미경 단계에 수술 준비 마우스를 전송합니다. 높은 배율 두 광자 angiographies으로 등록 기준지도로 사용할 4X 확대 명시야 조명을 사용하여 두개골 창 사이트의 초기 그림을 가져가라. </li><li> × 10 배율을 사용하여 관심 영역을 확대. 피질 층의 관심 분야를 선택 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의). 높은 배율이 원하는 경우 × 25 목표를 사용 </li><li> (Figu 시계열을 기록 시작2) 다시. 우리는 이미지의 품질을 높이기 위해 3-5 프레임의 평균을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 동물이 호흡하고있는 공기의 50 %의 N2를 추가하여 hypoxemia를 유도. 이것은 10 % 산소 수준을 가져올 것이다. 산소 농도계 데이터를 모니터링하여 hypoxemia을 확인합니다. </li><li> hypoxemia (예를 들어, 30 초)를 통해 시계열을 기록 계속하고, 정상 O2 수준은 복원 후. </li><li> , 검출 측정하고 혈관 주위 hypoxia와 산소를 조직 실린더의 영역을 quantifying하여 산소 분포의 계산에 대한 데이터를 수집합니다. </li></ol> 5. 데이터 처리 <ol><li> Krogh 조직 실린더 반경 R. 이것은 혈관의 중심과 높은 NADH의 형광이 감지되는 경계 사이의 거리를 측정하여 (그림 3)을 수동으로 할 수를 결정합니다. </li><li> 또는 조직 실린더 반경 R의 전산 탐정 독립적인 세미 - 자동 결정 및 중앙 blo를 사용하여보충 형태로 이전 1을 설명하고이 프로토콜의 토론 섹션에 요약되어 OD의 선박 R. </li><li> 오픈 액세스 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어 ImageJ를 사용하여 hypoxia의 영역을 결정합니다. 이렇게하려면 고가 NADH 조직 형광이있는 영역을 측정 후 높은 NADH 강도 영역을 delineates 임계값을 정의, NADH 신호를 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 2는 과도 hypoxemia (이 그림의 PDF 버전을위한, 선택한 스틸 이미지가 사용되었습니다) 중에 NADH / 혈관 조영술 이미지의 비디오를 표시합니다. 영감 산소 농도는 3 분 동안 21 %에서 10 % 인하되었다. 실험적으로 유도된 hypoxemia의이 수준은 대뇌 피질에 심한 hypoxia를 유발하기에 충분합니다. Hypoxia는 동맥 혈액 공급에서 멀리 있던 지역에 초기에, NADH 형광의 증가를 가져온다. 날카로운 NADH 조직 참고피질 microcirculation에서 산소 확산의 관찰할 조직 경계를 나타내는 경계. 그림 3의 이미지는 대뇌 혈관 주위의 산소 확산 경계의 지오메 트리를 보여줍니다. 그것은 이전에 한 설명한 바와 같이, 이러한 경계에서 실린더 직경 Krogh 추론할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> 그림 1. 이미징 준비 두개골 창에 (A) 마우스. (B) 헤드 플레이트의 치수. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> 그림 2. 내생 NADH 녹색 형광이 약 50 μm의 pial 표면 아래 두개의 창문을 통해 두 개의 광자 이미징과 시각. 혈관 텍사스 레드 dextran과 시각입니다. 흡입된 공기 중의 산소가 3 분 동안 10 % 감소하고 21% 위해 복원되었습니다. 스케일 바 : 50μm. &lt;IMG 고도 = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3. NADH 형광 경계 기하학. 노란색 테두리는 기능성 hypoxia의 경계를 표시, 파란색 동그라미가 예상 산소 (Krogh) 실린더를 보여줍니다. 블루 라인 실린더 반지름을 보여; 번호는 micrometers의 반지름을 보여줍니다.

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산소 확산에 대한 높은 공간적 해상도 정보는 뇌의 혈액 흐름이 뇌 세포에 산소를 제공하고, 신진 대사 수요를 충족하기 위해 규제하는 방법을 이해하는데 중요합니다. 클락 스타일의 유리 전극을 사용하여 전통 polarographic 산소 측정은 고도의 침해이며, 낮은 공간 해상도 2-3과 의미 (두 번째 범위) 응답 시간이 있습니다. 지금까지 뇌 조직에 PO 2를 측정하는 유일한 비침습 방법 흥분 프로브의 부패 비율이 산소 농도 4 ~ 비례 phosphorescence 담금질이다. 이 방법은 정확한 산소 농도을 제공하지만, 독자적인 염료와 기술적으로 정교한 phosphorescence 평생 이미징 시스템이 필요합니다. 여기서는 두 flurescence 채널과 표준 두 광자 이미징 시스템에서 수행할 수 간단, 단순한 접근법을 보여준다. 우리의 접근 방식은 내장 세포 신호 5 활용ND는 대뇌 피질의 microcirculation의 대조적인 시각이 필요합니다. 때문에 기능적으로 산소 농도에게 1 제한에서 NADH 형광의 비선형, 본질적 이진 증가로 인해 고유 NADH 형광은 크게, metabolically 제한 hypoxia와 지역에서 관찰되어 증가했다. 중요한 의미는 대뇌 피질의 microvessels에서 산소 확산의 조직 경계 직접 내생 NADH의 형광 cylindrically 모양의 밀도 변화에 의해 관찰할 수있다는 점이다. 혈관 주위 조직의 산소 볼륨을 정의 cylindrically 모양의 구조의 개념 8 월 Krogh에 의해 소개되었으며, 최근에 실험적으로 두 광자 NADH 이미징 1을 사용하여 관찰 되었기 때문에 우리는 Krogh 실린더 이러한 구조를 참조하십시오. Krogh 실린더 이미지는 이미지 프레임의 Z-스택을 복용하여 3 차원으로 수집 할 수 있습니다. 그들은 예리한 arterioles 부근에서 특히 유명하며 그들이 일치하는 기지입니다H는 소진 periarteriolar 조직 실린더의 1,4를 모세관. Krogh 조직 실린더 반경 R의 객관적 결정 (5.2 참조) 우리는 실린더의 중심과 Matlab 함수 &quot;improfile&quot;을 이용하여 바깥 경계 사이의 잘 정의된 세그먼트 내에 방사상 픽셀 강도 값을 측정을 제공한다. 세그먼트의 바깥쪽 경계는 보이는 경계 너머 안전 마진으로 연장하도록 선택되어야한다. 신호 대 잡음 수준을 향상시키려면 우리는 1 ° 단계에서 눈에 띄는 실린더 세그먼트를 충당하기 위해 필요한 모든 요골 대사 averageed. 세그먼트 내의 결과 평균 요골 강도 프로파일 보이는 조직 경계 R에 통신을 가파른 증가를 전시. 우리는 평균 요골 강도 프로필 sigmoidal 기능 (예 : 볼츠만 함수)를 맞게 및 R의 정의로서 반곡점을 (또한 X 0이라고도 함) 사용됩니다. 해당하는 두 개의 Photon microangiography (텍사스 빨간색)은 실린더의 중앙에 독방 중앙 혈관의 단면을 공개했다. 중앙 혈관의 지름이 직접 R을 결정하는 데 적용할 수 있습니다. 두 광자 NADH 영상은 피질 microangiography의 동시 고해상도 영상과 동일한 공간 해상도를 제공합니다. 이 방법의 정량 응용 프로그램의 중요한 특징은 P NADH 형광 증가 50 3.4 것으로 측정되어있다는 ± 0.6 mm HG 1과 그것 참 microregional 조직 PO 2의 함수로 NADH 형광 강도는 수학적으로 표현할 수 sigmoidal 기능. . 우리는이 기술 하나 hypoxia (10 %로 공기 중에 산소 함량을 감소하여)에 가장 취약한 뇌 영역을 식별할 수있는 표시됩니다. 우리는 또한 산소 확산은 간단한 기하학적인 perivascular 패턴을 따르는 것으로 나타났습니다. 하나 crit이 방법에 대한 ICAL 단계는 두개골 창 준비의 품질입니다. 수술은 노출된 지역으로 혈액 흐름을 방해하지 위해서는 최소한의 손상을 생산한다. 우려가 수술 손상 준비, 창 아래에있는 피질 어떤 의미있는 실험을 precluding,로 시작하는 hypoxic있을 수있다는 것입니다. 잘 준비된 두개골 창에서 모든 선박 유형의 생생한 혈액 흐름과 가장자리를 따라 노 상당한 출혈 상태로 그대로 전공 및 부전공 혈관이 있어야합니다. normoxic 조건에서 (PaO2 80-100 mmHg, SP O2 97-99%) 뇌 실질 조직이 높긴하지만 NADH의 형광과 눈에 밝은 조직 패치없이 균일 균질 NADH의 형광을 전시한다. 우리의 접근 방식의 근본적인 물리적인 제약이 깊이 침투가 제한됩니다. 뇌 속의 청록색 NADH의 형광은 이러한 파장의 헤모글로빈 흡수 및 조직 비산에 의해 급속하게 감쇠됩니다. 비록 높은 수치 조리개와 (예 : 1.05) 물침지 목표는 두 광자 NADH 이미징은 현재 피질 층 I 및 II로 제한됩니다. 또는 흰색 물질에 근접 에너지 대사 가능성이 회백질 다를 수 있기 때문에이 제한은 과학적으로 적합합니다. 그러나 이러한 레이어 IV-VI 또는 흰색 물질 책자 또는 striatum 같은 subcortical 구조로 깊이 피질 구조의 조사는 생체내 6 마우스 피질에서 설명한 특수 microlenses의 사용을 요구한다. 이러한 기능적인 충혈 및 모세관 유동 속도의 검출 7 분석과 같은 다른 측정과 결합하면 산소 확산 경계 NADH 기반의 측정은 특히 유용할 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 뇌졸중과 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 hypoxia를 시각적으로 적응 할 수 있습니다. 산소 확산의 간단한 기하학 하나는 모세관 밀도 드이다 상황에서 microvascular 침대에서 산소 그라디언트를 예측할 수8 (예 : AD 9) 주름잡은 감소 모세관 밀도가 뇌 세포 영역이 microstrokes에 의한 hypoxia 손해에 대한 증가 위험이 있는지 살펴보아야한다. 조직 hypoxia와 후속의 연결을 사망 또는 모세관 리모델링 10 ~ 이미지 능력 microregionally 또한 한 조직 microstrokes의 형상과 크기를 검사하여 hypoxia가 발생하는 조직의 볼륨을 확인할 수 있습니다뿐만 아니라 관계. 내생 NADH의 형광의 증가는 급성 mitochondrial 부전의 직접적인 결과이기 때문에 마지막으로,이 방법은 신경 에너지 대사 11 mitochondrial 부전 프록시에 대한 특정 기자로 NADH 이미징을 사용할 수있는 기회를 만듭니다. 결론적으로 내생 NADH 형광의 2 광자 영상 모두 정상 아래의 두뇌에 산소 공급과 소비를 이해하는 데 사용할 수있는 간단하고 undemanding 도구입니다그리고 pathologic 상태 인치

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 가열 패드 </td><td> Bodi 히트 너머 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 안과 연고 (인공 눈물) </td><td> 화이자 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-요오드 10 % 용액 </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 산화철 염화물 10 % 용액 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시멘트 </td><td> 회사 Stoelting </td><td> 51,456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> 하버드 장치 </td><td> 597,316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handpiece 키트 </td><td> 피어슨 </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 드릴 비트 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 # 5 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11,295 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 # 45분의 5 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 유리 coverslip </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Photomultiplier 관 </td><td> 하마 마츠 </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> 티 : 사파이어 레이저 마이 - 타이 </td><td> 스펙트럼 - 물리 </td><td> 및nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

신진 대사 수요가 높은 수준에서 작동하려면 두뇌의 능력은 혈류와 조직 산소 확산을 통해 지속적인 산소 공급에 따라 달라집니다. 여기에 직접 microregional 조직 hypoxia을 시각화하고 마우스 피질에서 perivascular 산소 그라디언트를 추측하는 시각화된 실험 및 방법론 프로토콜을 소개합니다. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH) 내생 형광 강도 및 조직 NADH 형광이 갑자기 10 mmHg 한 아래의 조직에 산소 수준에서 증가 관찰 조직에서 산소 분압 간의 비선형 관계를 기반으로합니다. 우리는 텍사스 레드 dextran와 대조 내장 NADH 조직 형광 및 혈장의 동시 여기를 허용 740 NM에서 두 광자 여기를 사용합니다. 기존의 접근 방법 이상이 방법의 장점은 다음과 같습니다 그것은 본질적인 조직 신호의 활용 및 생체내 인스턴트 메시지에 표준 두 개의 광자를 사용하여 수행할 수 있습니다장비를 노화, 그것은 ~ 50 μm의 깊이 해상도로보기의 전체 분야에서 지속적인 모니터링을 허용합니다. 우리는 대뇌 혈관에서 멀리 뇌 조직 영역 혈관 산소 공급의 감소에 따라 기능적으로 hypoxic 될 최초 취약한 유역 지역에 해당 보여줍니다. 이 방법은 이미지 microregional 피질 산소에 한 수 있으므로 neurovascular 질환과 뇌졸중의 불충 분한 또는 제한된 조직 산소 공급의 역할을 조사하는 데 유용합니다.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을 설명<em&gt; 생체내에서</em&gt;. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH)와 피질 microcirculation 동시에 두 개의 광자 이미징을 기반으로합니다. 이 방법은 조직 산소 공급의 고해상도 분석을 위해 유용합니다.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K 조회수.  University of Rochester Medical Center. 여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을 설명 생체내에서. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH)와 피질 microcirculation 동시에 두 개의 광자 이미징을 기반으로합니다. 이 방법은 조직 산소 공급의 고해상도 분석을 위해 유용합니다.

비디오: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.