Name: in-nucleus hi-c in drosophila cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

Bu çalışma UNAM Teknoloji Yenilik ve Araştırma Destek Programı (PAPIIT) hibe numarası IN207319 ve Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT-FORDECyT) hibe numarası 303068 tarafından desteklendi. A.E.-L. Bilim ve Teknoloji Ulusal Konseyi (CONACyT) CVU numarası 968128 tarafından desteklenen bir yüksek lisans öğrencisidir.

1. Fiksasyon
<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Schneider ortamında 17,5 mL hücre süspansiyonu hazırlamak için 10 milyon Schneider'ın hat 2 artı (S2R+) hücresiyle başlayın.</li>
	<li>Son konsantrasyonu% 2 elde etmek için metanol içermeyen formaldehit ekleyin. RT'de 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırarak her dakika karıştırmaya özen edin. NOT: Formaldehit tehlikeli bir kimyasaldır. Uygun sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine uyun ve duman kaputunda ...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+domains:+the+unit+of+chromosome+organization.">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease.">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements.">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li><li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells.">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer/promoter+function.">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li><li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li><li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation.">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li><li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics.">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li><li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy.">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains.">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li><li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization.">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li><li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure.">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403 (2013).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub.">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure.">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation.">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175 (2015).</li><li>Arzate-Mej&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila.">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894 (2020).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+capture+Hi-C:+high-resolution,+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions.">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259 (2015).</li><li>Philip, E., M&#229;ns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093 (2016).</li><li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCUP:+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data.">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310 (2015).</li><li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization.">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li><li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices.">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198 (2015).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle.">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites.">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Ong, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li><li>Fres&#225;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis.">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li><li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus.">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li><li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks.">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li><li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping.">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li><li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation.">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li><li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-BERST:+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2.">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li></ol>

Burada sunulan çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila genom topolojisinin yüksek çözünürlükte ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verdi, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimlerin bir görünümünü sağladı, organizatörler ve arttırıcılar gibi düzenleyici elementler arasındaki kromatin döngülerinden TAD'lere ve büyük bölmetanımlamasına 25. Aynı teknoloji bazı değişikliklerle memeli dokularına da verimli bir şekilde uygulanmıştır<sup class="xref...

Ökaryotlarda, genom, ara faz1sırasında nükleer alandaki belirli bölgeleri işgal eden kromozomlara bölünür. Kromozomları oluşturan kromatin iki ana hale ayrılabilir: biri transkripsiyonel olarak izin verilen erişilebilir kromatin ve diğeri transkripsiyonel olarak baskıcı olan kompakt kromatin. Bu kromatin durumları nükleer uzayda ayrışır ve nadiren karışır, çekirdekte iki ayrı bölme oluşturur2. Alt megabase ölçeğinde, sınırlar, kromozomal kuruluş3,4,5'i işaretleyen TAD adı verilen yüksek frekanslı kromatin etkileşimlerinin etki alanlarını ayırır. Memelilerde, TAD sınırları cohesin ve CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)6,7,8tarafından işgal edilir. Cohesin kompleksi kromatin ekstrüzyonları ve kararlı kromatin döngüleri oluşturmak için genomik dizideki yakınsak bir yönde bertaraf edilen CTCF bağlayıcı bölgelerde durur9,10,13,14. CTCF DNA bağlayıcı bölgenin sınırlarda genetik bozulması veya CTCF ve cohesin protein bolluğunda azalma, düzenleyici elementler arasında anormal etkileşimlere, TAD oluşumu kaybına ve gen ekspresyon deregülasyonuna neden olur9,10,11,13,14.
Drosophila'da, TAD'ler arasındaki sınırlar, sınır elemanı ile ilişkili faktör 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bağlayıcı protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), kıllı kanadın baskılayıcısı (SuHW) ve CTCF dahil olmak üzere çeşitliAP'ler tarafından işgal edilir ve aktif histone modifikasyonları ve Polymerase II16,17,18ile zenginleştirilir. Drosophila'da, TAD'lerin transkripsiyon13 , 17,19'unbir sonucu olarak ortaya çıktığı ve bağımsız AS'lerin sınır oluşumu ve yalıtım özelliklerindeki tam rolünün hala araştırıldığu ileri sürlenmiştir. Bu nedenle, Drosophila'daki etki alanlarının benzer transkripsiyon durumlarındaki bölgelerin toplanmasının tek sonucu olup olmadığı veya CTCF de dahil olmak üzere AP'lerin sınır oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığı tam olarak karakterize olmaya devam etmektedir. Genomik temasların yüksek çözünürlükte araştırılması, kromozom konformasyon yakalama teknolojilerinin geliştirilmesi ve yeni nesil dizileme ile mümkün olmuştur. Hi-C protokolü ilk olarak kromatin parçaları arasında sahte ligasyon ürünlerini önlemek amacıyla "çözeltide"2 gerçekleştirilen ligasyon adımı ile tanımlanmıştır. Bununla birlikte, birkaç çalışma, verilerdeki yararlı sinyalin, çözelti20,21'deolmayan kısmen lile çekirdeklerinde oluşturulan ligasyon ürünlerinden geldiğinin farkına işaret etti.
Protokol daha sonra tek hücreli Hi-C deneyi22'ninbir parçası olarak çekirdeğin içindeki ligasyonu gerçekleştirmek için değiştirildi. Çekirdek içi Hi-C protokolü daha sonra tüm genomik mesafelerde daha tutarlı bir kapsama alanı sağlamak ve daha az teknik gürültü ile veri üretmek için hücre popülasyonuHi-C'yedahil edildi23,24. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, çekirdek içi Hi-C protokolü23,24'e dayanmaktadır ve CTCF ve M1BP için DNA bağlayıcı motiflerin Drosophila25'teki Çentik gen çekirgesinde bir etki alanı sınırından genetik olarak çıkarılmasının sonuçlarını araştırmak için kullanılmıştır. Sonuçlar, sınırdaki AP'ler için DNA bağlayıcı motiflerin değiştirilmesinin Çentik etki alanı oluşumu, Çentik çekirgesini çevreleyen bölgelerde daha büyük topolojik kusurlar ve gen ekspresyon deregülasyonu için büyük sonuçlar doğurdığını göstermektedir. Bu, etki alanı sınırlarındaki genetik elementlerin Drosophila25'tegenom topolojisinin ve gen ekspresyonunun sürdürülmesi için önemli olduğunu gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CA1524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVARIS Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>LE220-M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B72002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Dna PolI large fragment</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow exo(-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40-Igepal</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CA-420</td>
			<td>Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG 
			GAATGCCGAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT 
			CTACACTCTTTCCCTACACGACG 
			CTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
			ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA 
			ACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1 (known interaction, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2 (known interactions, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI Beads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (PNK)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPhusion</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant for quenching of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-nucleus hi-c in drosophila cells

Genom, etki alanları arasındaki etkileşimleri yalıtlayan sınırlarla sınırlandırılmış topolojik olarak ilişkili etki alanları (TAD' ler) halinde düzenlenmiştir. Drosophila'da TAD oluşumu ve sınırlarının altında kalan mekanizmalar halen araştırılmaktadır. Burada açıklanan çekirdek içi Hi-C yönteminin uygulanması, Çentik genini izole eden TAD sınırlarında mimari protein (AP) bağlayıcı bölgelerin işlevinin parçalanarak parçalanmasına yardımcı oldu. APS kaybına neden olan etki alanı sınırlarının genetik modifikasyonu TAD füzyonu, transkripsiyon kusurları ve uzun menzilli topolojik değişikliklerle sonuçlanır. Bu sonuçlar, Drosophila'da genetik elementlerin etki alanı sınır oluşumuna ve gen ekspresyon kontrolüne katkısını gösteren kanıtlar sağlamıştır. Burada, protokolle birlikte deneyin kalitesini değerlendirmek için önemli kontrol noktaları sağlayan çekirdek içi Hi-C yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, farklı genomik ölçeklerdeki genomik etkileşimleri analiz etmek için gerekli sayıda sıralama okuması ve geçerli Hi-C çiftleri gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 aracılı genetik düzenleme düzenleyici unsurların ve bu çekirdek içi Hi-C protokolü kullanılarak genomik etkileşimlerin yüksek çözünürlüklü profillenmesi, genetik elementlerin yapısal işlevinin araştırılması için güçlü bir kombinasyon olabilir.

Aşağıda başarılı bir Hi-C protokolünün sonuçları açıklanmıştır (Şekil 1A'dakiHi-C protokolü iş akışının özetine bakın). Çekirdek içi Hi-C deneyi sırasında çeşitli kalite kontrol noktaları vardır. Örnek aliquots önce (UD) ve sonra (D) kromatin kısıtlama adımı yanı sıra ligasyon (L) sonra toplanmıştır. Çapraz bağlar tersine çevrildi ve DNA arındırıldı ve agarose jel üzerinde çalıştırıldı. Mbo I ile kısıtlama başarılı olduğunda 200-...

Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Çekirdek Hi-C protokolleri, kromatin döngülerinin, etki alanlarının ve genomu düzenleyen bölmenin karakterizasyonu için kromozomal onayın farklı çözünürlükte araştırılmasına izin verir. Bu protokol, genomik etkileşimlerin farklı ölçeklerde yüksek çözünürlüklü profillenerek, daha az teknik gürültü ile tüm genomik mesafeler ve veriler arasında daha tutarlı bir kapsama alanı sağlar. Bu protokolü genetik düzenleme ile birleştirmek, genetik elementlerin yapısal işlevini test etmek için güçlü bir stratejidir.Hastalığa yol açan yapısal varyasyonların karakterizasyonuna da uygulanabilir. Çekirdek Hi-C protokolü, herhangi bir ökaryotik genomun genom organizasyonunu araştırmak için uygulanabilir. SDS ve Triton tedavisi yapmak, agregalar enzymatic reaksiyon verimliliğini kesintiye uğrattığından ve sıralamadan önce uygun kalite kontrolleri ölçüsünü gerçekleştirdiğinden emin olarak pipetleme ile herhangi bir nükleer kümeyi ayırır.17,5 mililitre Schneider ortamındaki yedi Schneider's Line 2 Plus Drosophila hücresine bir kere 10'a metanol içermeyen formaldehit ekleyerek başlayın% 2'lik son konsantrasyona% 10 FBS ile desteklenmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her 60 saniyede bir veya dönen bir tekerlek üzerinde karıştırın, ve karıştırma ile 0.125 azı dişi son konsantrasyona glisin ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika ve buzda 15 dakika sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 25 mililitre soğuk PBS'de dikkatlice yeniden depolayın ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemenin sonunda, hücreleri saymak için bir mililitre buz soğuk liziz tamponunda yeniden depolayın ve hücreleri mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye bir kez 10'a ayarlayın.Hücreleri buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırarak, hücreleri başka bir santrifüjle karıştırmak ve toplamak için her iki dakikada bir tüpü ters çevirin. Peletin bir mililitre taze buz gibi soğuk liziz tamponunda yeniden depolansın. Santrifüjlemeden sonra, lisatı bir mililitre 1.25X kısıtlama tamponu ile yıkayın.Lisat toplamak için tekrar santrifüj. Peletin 360 mikrolitre taze kısıtlama tamponunda ve %10 SDS'nin 11 mikrolitresinde dikkatli pipetleme ile yeniden süzülün ve 37 santigrat derecede 45 dakika ve zaman zaman pipetleme ile dakikada 7 ila 950 devir inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, 75 mikrolitre iyonik olmayan yüzey aktif madde ile permeabilizasyonu durdurun ve tüpü zaman zaman pipetleme ile dakikada 950 devirde sallanarak 45 dakika daha inkübatöre geri verin.Kromatin sindirimi için, dönüş ile 37 santigrat derecede dört ila 16 saatlik bir inkübasyon için tüpe 200 ünite Mbo1 ekleyin. Kuluçkanın sonunda, enzimi 60 santigrat derecede 20 dakikalık inkübasyonla inaktive edin. Kısıtlama parçası çıkıntılarını doldurmak ve DNA uçlarını biotin ile etiketlemek, 10 milimoler dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikrolitre 0,4 milimoler biotin dATP, 17,5 mikrolitre tris düşük EDTA tamponu ve 10 mikrolitre DNA polimeraz başına beş üniteden oluşan 10 mikrolitreyi dikkatli bir karıştırma ile tüpe ekleyin.Reaksiyonun 75 dakikasını 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 30 saniye boyunca her 10 saniyede bir dakikada 700 devirde sallayın. Kuluçkanın sonunda, ligasyon karışımını kromatin'e ekleyin ve bir mililitre son reaksiyon hacmine iyice yumuşak karıştırma ile ayarlayın ve 16 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Örnek proteinleri bozmak için, 37 santigrat derecede iki saatlik bir inkübasyon için tüpe mililitre proteinaz K başına 10 miligram 50 mikrolitre ekleyin.Kuluçkanın sonunda, numuneyi çapraz bağlamayı tersine çevirmek için sıcaklığı bir gecede 65 santigrat dereceye çıkarın. Ertesi sabah, mililitre RNAse A.'da mililitre başına 10 miligramlık 10 mikrolitre ile RNA'yı düşürün. DNA'yı standart protokollere göre çökelendirdikten sonra, üreticinin talimatlarına göre SEÇICI olarak DNA'ya ve florometreye bağlanan florojenik bir boya kullanarak DNA'yı ölçün.DNA'yı sindirilmemiş ve sindirilmiş aliquotlardan arındırmak için, 100 nanogram sindirilmemiş, sindirilmiş ve lige edilmiş numuneyi%1,5 agarose jel üzerine yükleyin ve sindirilmiş örnekte yaklaşık 500 baz çifti ortalanmış bir smear ve ligated örnek için yüksek moleküler ağırlık bandı arayın. Bilinen bir etkileşimin amplifikasyonu ve sindirimi ile Hi-C işaretleme ve ligasyon verimliliğini doğrulamak için, PCR'den sonra, ürünleri Mbo1, Cla1 veya her ikisiyle de sindirin ve örnekleri 3C ve Hi-C ligasyon bağlantılarının göreli sayısının tahmin edilmesine izin vermek için yeni bir % 1,5 ila% 2 jel üzerinde çalıştırın. 200 ila 500 baz çifti DNA parçası elde etmek için numuneyi sonicating sonra, Her örnekten beş mikrogram DNA içeren 130 mikrolitreyi 10X ligasyon tamponunun 16 mikrolitresini, 10 milimolar dATP'nin iki mikrolitresini, beş mikrolitre T4 DNA polimerazını ve 20 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için yedi mikrolitre çift damıtılmış su içeren yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın.Kuluçkanın sonunda, 10 milimoler dNTP'den beş mikrolitre, 10X ligasyon tamponunun dört mikrolitresi, beş mikrolitre T4 polinükleotid kinaz, bir mikrolitre DNA polimeraz bir büyük parça ve 20 santigrat derecede ikinci bir 30 dakikalık inkübasyon için tüplere 25 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Parçaları çoğunlukla 250 ila 550 baz çift boyut aralığında seçmek için, 0,6X ile sıralı katı faz geri dönüşümlü ve mobilizasyon boyutu seçimi, ardından üreticinin talimatlarına göre 0,9X gerçekleştirin ve DNA'yı 100 mikrolitre tris düşük EDTA ile elüte edin. Her kütüphane için biotin çekme için, Streptavidin bağlantılı manyetik boncukların 150 mikrolitresini 400 mikrolitre 1X Ara tamponu ile iki kez yıkayın ve numuneleri dönen bir tekerlek üzerinde üç dakika döndürün.Kuluçkanın sonunda, boncukları 300 mikrolitre 2X ara tamponda yeniden ıslatın ve dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakikalık bir dönüş için 300 mikrolitre Hi-C malzemesi ile karıştırın. Kuluçkanın sonunda, boncukları 400 mikrolitre 0,5X Ara tamponu ile 55 santigrat derecede üç dakikalık bir inkübasyon ve dakikada 750 devir için yıkayın, ardından yıkama başına 200 mikrolitre 1X kısıtlama tamponunda iki yıkama. İkinci yıkamadan sonra, boncukları 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için 100 mikrolitre dATP kuyruk karışımında yeniden ıslatın.Kuluçkanın sonunda, boncukları 50 mikrolitre 1X ligasyon tamponunda yeniden ıslatın ve süspansiyonu dört mikrolitre önceden tavlanmış eşleştirilmiş uç adaptörü ve iki mikrolitre T4 ligase içeren yeni bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında iki saat sonra, süpernatantı çıkarın ve boncukları 400 mikrolitre Ara tamponu ile iki kez yıkayın, ardından boncukları 1X kısıtlama tamponunun 40 mikrolitresinde yeniden askıya almadan önce 200 mikrolitre ara tamponu ile bir kez ve bir kez de 100 mikrolitre kısıtlama tamponu ile yıkayın. Mbo1 ile kısıtlama başarılı olduğunda 200 ila 1.000 baz çifti smear görülür.Ligasyon başarılı olursa, jelin üst kısmında yüksek moleküler ağırlık bandı görülür. Sindirim verimliliği nicel PCR ile de doğrulanabilir. Kabul edilebilir bir sindirim verimliliği% 80 veya daha yüksektir.Gösterildiği gibi, Hi-C ligasyon ürünlerinde bilinen bir orta menzilli etkileşimin amplifikasyonu, amplifikasyonda geri kazanılan PCR ürününün sindirimi ile tahmin edilebilir. Sıralamadan sonra kütüphaneler için yararlı olmayan okumaların büyük bir oranına sahip olmamak için% 70'ten fazla bir sindirim verimliliği önerilir. Son amplifikasyon için PCR döngülerinin sayısı, smear'ın görünür olduğu döngü sayısından bir döngü daha az olmalıdır.Kitaplığın sindirim düzeyi, geçerli Hi-C çiftlerinin bolluğunu gösterir ve kütüphaneden elde edilecek yararlı okumaların oranını yansıtır. Benzersiz geçerli Hi-C çiftleri kullanılarak, çift dağılımının temel analizi yapılabilir. Bu temsili örnekte de görüldüğü gibi, NOTCH gen lokusu, lokus boyunca mimari proteinler, etki alanları bir ve iki ve histon değişiklikleri ile birlikte görülebilir.Hem CTCF hem de M1BP DNA bağlama bölgelerini içeren bölgenin silinmesiyle kromatin kontaklarında çarpıcı bir değişiklik gözlenebilir. Hi-C deneyinden sonra, örneğin organizatör bölgelerinden belirli bir kişi kümesine ulaşmak için bir gerçekleştirilebilir. Bu özellikle büyük genomları değerlendirirken yararlıdır.Gösterildiği gibi, Hi-C protokolünü genetik ekleme ile birleştirmek, genomik elementlerin yapısal ve düzenleyici işlevini değerlendirmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...