Protokolümüz mitoz sırasında ki spacial ve temporal dinamik olayları belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda gerçek zamanlı olarak mitotik regülatörlerin etkilerini görselleştirmek için kullanılabilir. Çift renkli görüntüleme kullanarak iki moleküler belirteçleri eşzamanlı analiz sağlar. Örneğin, mitotik milin mikrotübüllerini ve çoğaltılmış kromozomların kinetik çekirdek yapısını görselleştirebiliriz.
Floresan protein ekspresyonunu indüklemek için, RNA girişim tedavisinden dört gün sonra, indükleyici metallo-thyanin organizatörü hücreleri 24 ila 36 saat boyunca 500 mikromolar bakır sülfatın son konsantrasyonuna maruz bırakır. Floresan protein ifade hücreleri görüntüleme için hazırlamak için, steril 15 mililitretüp hücreleri transfer, ve, sayma sonra, santrifüj ile hücreleri tortu. Taze pelet resuspend, 25 derece Santigrat SIM ısıtılmış, ile takviye 10%FBS, mililitre konsantrasyonu başına 6 hücrelere iki kez 10, ve ek ile hücreleri tedavi 500 mikromolar bakır sülfat.
Daha sonra çok iyi canlı hücre odasının bir kuyuya 200 ila 500 mikrolitre hücre ekleyin ve odayı ters floresan mikroskop aşamasına yerleştirin. Hücreler odaya yerleşirken, canlı hücre görüntüleme yazılımını açın ve yeni ve deney'i tıklatın. Görüntülerin çekilecek bir zaman atlamalı döngü eklemek için, zaman atlamalı döngü simgesini tıklatın.
Aralığı saniyeye ayarlayın ve döngü sayısını ayarlamak için istenen genel deneme uzunluğunu saniyecinsinden saniyeler içinde bölün. Döngünün istenilen toplam zaman diliminde tekrarlayabilmesini bekleyin. Hedefin odağı korumak için bir kızılötesi odak denetimi eklemek için, xy hareketini tıklatın ve zaman atlama döngüsü katmanı içinde Z kayması telafisi adımı eklemek için Z sürüklenme telafisi seçin.
Çok kanallı bir görüntünün edinimine izin vermek için, çok kanallı grup katmanı eklemek için çok kanallı grup simgesini tıklatın ve Z yığını döngü katmanı eklemek için Z yığın döngü simgesini tıklatın. Ardından istediğiniz adım boyutunu ve dilim sayısını ayarlayın ve fotoğraf beyazlatma işlemini en aza indirmek için her kanalın pozlamasını mümkün olduğunca düşük bir düzeye ayarlayın. Bir hücre bölünmesini görüntülemek için, 40 veya 60 kez yağ daldırma hedefi ve mCherry floresan kanalı seçin ve hedefi kuyunun üst veya alt kısmında hizalayın.
Sonra Z sürüklenme tazminat adım ile girişim önlemek için dikey iyi bölücü uzak hareket. Geç G2 veya erken M aşamasında bir hücre veya hücre bulun ve yazılım ekranında hücreleri görüntülemeye başlamak için canlı görünüm düğmesini tıklatın. G2'den M'ye geçişte uygun hücreleri bulmak hücre bölünmesini görüntülemenin anahtarıdır.
Sağlam bir çekirdek ve en iyi sonuçlar için tam olarak iki centrosomes ile bir hücre bulun. Mikroskobun ince odak düğmesini kullanarak, ilgi hücrelerine odaklanın ve kızılötesi odak denetimini ayarlamak için ofset bul'u tıklatın. Zaman atlamalı görüntüleme programını başlatmak için başlat'ı tıklatın ve istenilen kanalı seçin ve histogramları gerektiği gibi ayarlamak ve ilgi hücrelerini net bir şekilde görselleştirmek için ortalama piksel yoğunluklarını ayarlayın.
15-20 dakika sonra hücreleri kontrol edin ve hücre merkezinin yakınındaki yuvarlak, karanlık kırılan noktanın kaybolmasıyla belirlenen nükleer zarf arızasının meydana geldiğini doğrulayın. 15 ila 20 dakika sonra, anafaz başlangıcının oluşup oluşmadığını kontrol edin. Sonra programı durdurun ve dosyayı kaydedin.
Anafaz başlangıç zamanlaması için nükleer zarf dökümünü belirlemek için, nükleer zarf dökümü zamanını ve ilk kromozom ayrılma süresini dakikalar içinde belirlemek için çerçeve yi tıklatın ve belirli bir hücreiçin anafaz başlangıç süresine nükleer zarf dökümünü elde etmek için başlangıç saatinden arıza süresini çıkarın. Daha sonra, ilk yerleşmeden itibaren 12 saate kadar belirli bir koşul için birden fazla uç elde etmek için önceden bölen hücreleri taramaya devam edin. Bölmek üzere olan hücreler, alfa tubulin kanalında görüntülendiğinde kırılan ışık ve hücre içindeki daha karanlık bir nokta ile gösterildiği gibi, iki centrozom ve bozulmamış bir çekirdeğin varlığı yla hedeflenebilir.
Nükleer zarf dökümü bu karanlık noktanın kaybolması ile görüntülenebilir, sitoplazmanın düzgün renklendirmesi ile sonuçlanan. Nükleer zarf dökümünden sonra, her hücrenin mili oluşturmak ve kromozomları ayırmak ve ayırmak için aldığı süre, bu olayların nükleer zarf dökümüne göre zaman noktaları belirtilerek ölçülebilir. Çift iplikçikli RNA ile tedavi shortstop karşı hedef, hücre döngüsü dinamiklerini etkilemek için şüphelenilen bir aktin mikrotübül çapraz bağlama protein önemli bir mitotik gecikme ile sonuçlanır.
Bu tedavi önemli bir gecikme ile sonuçlanır, birçok hücre metafazda arresting ve tüm iki ila üç saatlik görüntüleme deneyi sırasında anafaz geçiş asla. Bu kontrol noktasının önemli bir bileşeni olan atış ve kaba anlaşmaya karşı çift iplikli RNA ile birlikte tedavi edilmesi, tutuklama fenotipinin bastırılmasına yol açarak, kontrollü, işlenmemiş hücrelere benzer anafaz sürelerine nükleer zarf dökümüyle sonuçlanır. Uygun hücreleri seçtiğinizden emin olun ve bölünmeye başlamayan görüntüleme hücrelerini görüntülemezamanını boşa harcamayın.
Bir hücre 20 dakika içinde bölünmeye başlamazsa, başka bir hücre bulun. Araştırmacılar yeni mitotik düzenleyiciler, ya da muhtemelen hücre bölünmesi belirli olayları etkileyen yeni kuru bileşikler belirlemeye yardımcı olmak için bu prosedürü takip edebilirsiniz.
